利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探

为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。

长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在鸡巨噬细胞中增殖

研究表明,源自内源性反转录病毒的长非编码RNA可能是巨噬细胞抗病毒免疫反应的重要组成部分。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与宿主遗传抗性有关,能够激活非免疫细胞抗病毒天然免疫反应。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在鸡巨噬细胞中的抗病毒作用及其机制,本研究通过荧光定量PCR发现lnc-ALVE1-AS1在ALV-J感染鸡巨噬细胞系HD11后24 h显著下调。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1可以显著抑制ALV-J在HD11细胞中增殖。机制上,lnc-ALVE1-AS1显著上调HD11细胞dsRNA识别受体(TLR3)、Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)和其他抗病毒天然免疫基因(IRF7、MX1、OASL和IFITM3)表达。然而,干扰TLR3或者抑制TLR3信号后lnc-ALVE1-AS1诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)的能力显著减弱。共聚焦定位分析显示在HD11细胞中lnc-ALVE1-AS1可以与TLR3蛋白直接结合。这说明激活TLR3信号可能是lnc-ALVE1-AS1抑制ALV-J在巨噬细胞中增殖的一个重要机制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在巨噬细胞中抗病毒功能及其作用机制,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

DNA甲基化抑制剂DAC处理对鸡Wnt10a基因表达及其启动子甲基化的影响

Wnt10a基因在细胞增殖、分化及迁移中发挥着重要作用,参与调控机体生长发育的诸多生物学过程,但对鸡Wnt10a基因表达的表观遗传调控机制尚不清楚。为探究DNA甲基化对Wnt10a基因表达的影响,以DMSO处理为对照组,5-Aza-2’-deoxycytidine (DAC)处理为试验组,分别用0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μmol·L^(-1)浓度的DAC处理鸡胚成纤维细胞DF-1,通过RT-qPCR分析比较Wnt10a基因在DAC和DMSO处理后的表达水平;同时通过NCBI数据获取Wnt10a启动子区序列,设计亚硫酸氢盐测序(BSP)引物,5.0μmol·L^(-1) DAC处理鸡胚成纤维细胞DF-1 48 h,焦磷酸测序分析鸡Wnt10a基因上游部分CpG位点的甲基化水平。结果表明:相对于DMSO处理,DAC处理Wnt10a基因表达量极显著上调,且上调幅度随DAC处理浓度的升高而升高;同时Wnt10a基因上游CpG位点甲基化水平显著下降。综合而言,DNA甲基化抑制剂DAC可显著降低鸡Wnt10a基因起始位点上游序列部分CpG位点的甲基化水平,并激活Wnt10a基因的表达。

ALV-J下调鸡MARCO转录水平拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

为研究鸡巨噬细胞受体(MARCO)基因与J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染两者间的关联,先过表达ALV-J env基因不同结构域后通过RT-qPCR检测MARCO基因mRNA的转录水平,再构建MARCO真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测MARCO过表达对ALV-J复制水平的影响,最后通过RT-qPCR检测MARCO过表达对巨噬细胞天然免疫相关基因TLR3和IFIH1转录水平的影响。结果表明:ALV-J env蛋白对MARCO基因mRNA转录水平有极显著抑制作用;过表达MARCO极显著抑制ALV-J病毒的复制;过表达MARCO后,TLR3和IFIH1基因mRNA转录水平均极显著上调。这一研究揭示了MARCO基因在ALV-J感染巨噬细胞后的动态转录水平规律及其抑制ALV-J增殖的功能,其可能通过诱导天然免疫基因TLR3、IFIH1高转录水平的途径来实现抗病毒作用,为今后研究MARCO的功能及治疗禽白血病提供了新的思路。

DNA甲基转移酶N6AMT1基因敲降和过表达及其功能初探

6mA甲基化是DNA甲基化修饰的一种重要方式,受甲基转移酶N6AMT1基因的调控。为研究N6AMT1基因的功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建N6AMT1基因敲降的HEK293细胞系,同时在Hela细胞系中过表达N6AMT1基因,检测N6AMT1基因表达变化对细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:正常肾上皮组织细胞系HEK293中N6AMT1基因表达水平显著高于癌细胞;正常肝细胞系LO2中N6AMT1基因表达水平显著高于肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721;N6AMT1基因敲降显著增强HEK293细胞的增殖及迁移能力;而Hela细胞过表达N6AMT1基因后,细胞的增殖和迁移均显著受到抑制。这一研究提示N6AMT1基因介导的6mA甲基化可能对细胞增殖和迁移有重要影响。

鸡c-myc原癌基因反义RNA的鉴定及其抗ALV-J能力的分析

原癌基因c-myc被鉴定为J亚群禽白血病病毒(ALV-J)诱导髓样细胞瘤的常见整合位点,其异常激活可能是ALV-J最重要的分子致病机制。为了鉴定c-myc反义RNA对c-myc基因表达的影响及其在ALV-J增殖中的作用,本研究通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术、PCR扩增5’-race和3’-race后对其编码属性的分析鉴定结果显示,鸡c-myc原癌基因反义RNA全长621 bp,且不编码蛋白;该反义RNA序列定位于鸡2号染色体,且源自c-myc外显子3反向序列,因此将其命名为ch-MYC-AS1。将ch-MYC-AS1连接载体pcDNA3.1,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ch-MYC-AS1,将其转染至鸡巨噬细胞细胞系HD11,培养48 h后利用荧光定量PCR和western blot检测ch-MYC-AS1过表达对c-myc表达的影响,结果显示,过表达ch-MYC-AS1可以显著抑制c-myc原癌基因在HD11中的表达。以MOI 5的ALV-J(JS09GY3株)感染HD11细胞4 h后,将pcDNA3.1-ch-MYC-AS1质粒转染该细胞,48 h后采用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测细胞上清中ALV-J p27蛋白的表达水平,结果显示过表达ch-MYC-S1显著减少细胞上清中ALV-J p27蛋白的表达;进一步通过荧光定量PCR、western blot检测过表达ch-MYC-AS1对ALV-J复制的影响,结果显示,ALV-J env基因mRNA转录水平和蛋白表达水平在ch-MYC-AS1转染后48 h的HD11细胞中均显著下调(P<0.01);利用间接免疫荧光技术检测DF-1细胞上清中ALV-J的病毒效价,结果显示:与对照组相比,HD11细胞上清中ALV-J的病毒效价在ch-MYC-AS1转染后48 h明显降低。上述结果表明过表达ch-MYC-AS1可以显著抑制ALV-J在HD11细胞中的增殖。本研究首次揭示了原癌基因c-myc反义RNA的抗病毒功能,为进一步探究c-myc基因在ALV-J致病机理中的作用提供了参考依据。

白来航鸡IFITM1基因表达规律分析及其对鸡内源性反转录病毒转录的影响

IFITMs在天然免疫中发挥重要作用,抑制多种病毒复制。试验取5和30日龄白来航鸡心、肝、脾、胸腺和法氏囊,RT-qPCR检测其IFITM1基因的表达差异;用0.5μmol·L^-1 DNA甲基化酶抑制剂DAC处理鸡成纤维细胞CEF和鸡巨噬细胞HD11,RT-qPCR检测处理后IFITM1的表达水平;PCR扩增IFITM1基因CDS区克隆、测序,进而构建pcDNA3.1-IFITM1真核表达载体;将过表达载体转染至CEF和HD11细胞,RT-qPCR检测IFITM1过表达对鸡内源性反转录病毒ALVE1、OVEX1和EAV-HP转录的影响。结果表明:IFITM1基因在胸腺、法氏囊等免疫器官中的表达量高于心、肝和脾等非免疫器官,且随着日龄的增长,在胸腺中的表达量上升,而在法氏囊中的表达量下降;DAC处理后,IFITM1表达极显著上调;测序发现IFITM1基因CDS区大小为342bp;IFITM1过表达后,ALVE1、OVEX1在CEF和HD11细胞中转录均极显著下调,EAV-HP只在CEF细胞中极显著下调,而在HD11细胞中无显著变化。这一研究初步分析了鸡IFITM1基因的表达规律,构建了其真核表达载体,检测了其对鸡内源性反转录病毒转录的影响,为进一步研究其功能奠定了基础。

长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1与禽白血病病毒抗性和易感品系鸡相关性分析

内源性反转录病毒是长非编码RNA的重要来源,在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。鸡内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA lnc-ALVE1-AS1能够激活细胞免疫功能并抑制禽白血病病毒增殖。为进一步探讨lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性和易感品系鸡中的表达规律及其与禽白血病病毒抗性的相关性,本研究通过荧光定量PCR发现,lnc-ALVE1-AS1在ALV抗性(G1)品系鸡免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)和CEF细胞中的表达水平显著高于ALV易感(G3)品系鸡。病毒感染实验表明lnc-ALVE1-AS1在ALVJ感染CEF(G1和G3来源)细胞24h和96h后均显著下调;但是,lnc-ALVE1-AS1在G3来源CEF细胞中的表达水平下降更为明显,且ALVJ病毒复制水平显著高于G1鸡来源的CEF细胞。进一步通过lnc-ALVE1-AS1过表达实验证实,lnc-ALVE1-AS1不仅可以显著上调G3来源CEF细胞dsRNA识别受体(TLR3和IFIH1)和抗病毒天然免疫基因(IFI27-L2、IFIT5、IFITM3、IFN-β、ISG12-2和RASD2)表达,还显著抑制ALVJ复制。本研究揭示了lnc-ALVE1-AS1在禽白血病病毒抗性和易感品系鸡细胞和免疫组织器官中的表达规律和抗病毒功能,为抗病育种研究提供了新的遗传基础。

G0S2抑制ALV-J在鸡巨噬细胞中增殖

G0/G1期开关基因2(G0/G1 switch 2,G0S2)在脂肪稳态、细胞增殖和肿瘤发生等生物学过程中扮演着重要角色,而有关G0S2基因在家禽抗病毒免疫中的研究相对甚少。为探讨G0S2基因在鸡巨噬细胞中的抗病毒作用及其机制,构建G0S2真核表达载体并转染鸡巨噬细胞系HD11细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测G0S2过表达对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)复制水平、天然免疫基因TLR3和糖酵解关键调控基因MYC表达的影响。结果表明:G0S2过表达可显著抑制ALV-J在HD11细胞中增殖。G0S2显著上调HD11细胞内双链RNA(dsRNA)识别受体基因TLR3表达,并抑制糖酵解调控基因MYC表达,说明激活TLR3表达和抑制MYC表达可能是G0S2基因抑制ALV-J在巨噬细胞中增殖的重要机制。综上,该研究揭示了鸡G0S2在巨噬细胞中的抗病毒功能及其作用机制,为今后研究G0S2的功能及其宿主遗传抗性提供了参考依据。

过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体的抗衰老作用

NAMPT是NAD+补救合成途径的限速酶,具有抗衰老作用。外泌体是一种包含蛋白质、miRNA、mRNA、lncRNA等内容物的天然内源性载体。利用慢病毒方法构建NAMPT过表达的人脐带间充质干细胞系,获得过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体,随后通过与人皮肤成纤维细胞共培养和饲喂秀丽隐杆线虫,研究过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体对其抗衰老的影响。结果表明:基因修饰后脐带间充质干细胞及其外泌体内NAMPT蛋白含量显著升高,并能促进人皮肤成纤维细胞增殖和延缓人皮肤成纤维细胞衰老;同时能延长秀丽隐杆线虫寿命和增加秀丽隐杆线虫抗氧化能力。这一研究提示过表达NAMPT基因的间充质干细胞外泌体具有一定的抗衰老作用。

脐带间充质干细胞及其外泌体对宫颈癌HeLa细胞的作用初探

人脐带间充质干细胞是一种多能干细胞,可用于多种疾病的临床治疗。利用从人类脐带分离的间充质干细胞,以及从该间充质干细胞的培养液中分离提取的外泌体,通过与宫颈癌HeLa细胞共培养,研究间充质干细胞及其外泌体对HeLa细胞生物学表型的影响。结果表明:脐带间充质干细胞共培养均极显著抑制HeLa细胞的增殖、迁移及侵袭等表型,并极显著促进HeLa细胞凋亡。脐带间充质干细胞来源的外泌体处理HeLa细胞后,细胞增殖、迁移及侵袭也同样受到极显著抑制,并极显著促进细胞凋亡。这一研究提示脐带间充质干细胞及其外泌体并未在体外培养条件下促进HeLa细胞的生长、迁移,相反对HeLa细胞的表型具有一定的抑制作用。

内源性反转录病毒衍生的长非编码RNA的功能

长非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白质的RNA分子,以RNA的形式参与多层次调控,包括表观遗传学调控、转录调控以及转录后调控等。大量研究结果表明,许多长非编码RNA分子衍生于数百万年前＂入侵＂人类基因组的内源性反转录病毒（endogenous retrovirus,ERV）序列。内源性反转录病毒是基因组重要成分,约占基因组的5%~8%,多以＂前病毒＂形式存在,功能很大程度上未知。就内源性反转录病毒衍生的lncRNA在天然免疫、抗病毒和肿瘤等方面的最新研究进展进行综述。

鸡巨噬细胞CCL4抗禽白血病病毒作用及其机制初探

为了探究CCL4基因抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的作用机制,观察了CCL4基因在ALV-J感染鸡巨噬细胞(HD11)不同时间(6,12,24,36,48h)后的表达规律,分别构建CCL4、ALV-J env、ALV-J GP85和ALV-J GP37真核表达载体并转染HD11细胞,通过RT-qPCR检测CCL4过表达对ALV-J复制水平及CCL4受体CCR5和其下游天然免疫相关基因及其他抗病毒基因的表达水平的影响,同时分析ALV-J env对CCL4基因表达的影响。结果显示:ALV-J感染HD11细胞后主要抑制CCL4表达(P<0.01);ALV-J env蛋白对CCL4有显著抑制作用(P<0.01);而过表达CCL4显著抑制了ALV-J病毒复制(P<0.01);CCL4可能通过激活抗病毒基因S100A9及其上、下游通路抑制ALV-J病毒增殖。本研究揭示了CCL4在病毒感染后巨噬细胞中的动态表达规律及其抗ALV-J作用,为今后研究CCL4的功能及其宿主遗传抗性奠定基础。