重组可溶性MHCI类相关蛋白A对NK细胞生物学活性的影响

目的:研究体外重组可溶性MHCI类相关蛋白A(sMICA)对NK细胞杀伤靶细胞活性、分泌IFN-γ、增殖和凋亡的影响。方法:将重组sMICA蛋白与人外周血NK细胞相互作用过夜后,流式细胞仪检测NK细胞杀伤K562靶细胞的能力;ELISA检测培养上清IFN-γ浓度;MTS/PMS法检测sMICA对NK细胞增殖的影响;给NK细胞标记Annexin V和碘化丙啶检测凋亡情况。结果:可溶性MICA抑制NK细胞杀伤K562细胞的活性,下调IFN-γ的分泌,却对NK细胞的增殖和凋亡没有影响。结论:肿瘤细胞表面脱落的sMICA抗原可通过抑制NK细胞活性而逃逸机体的免疫监视功能。

负载pcDNA3.1-EGFP壳聚糖纳米颗粒的制备及其生物学特性分析

目的 制备并鉴定负载pcDNA3.1-EGFP质粒的纳米颗粒,观察其细胞转染效率及细胞毒性.方法 首先将壳聚糖和质粒DNA按不同质量比混合,制备成纳米颗粒,计算其包封率,测定其粒径和Zeta电位.其次分别将纳米颗粒与RAW264.7和CT-26细胞孵育,荧光显微镜观察2两种细胞内绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测荧光细胞的频率.最后利用MTS/PMS法检测纳米颗粒对RAW264.7和CT-26细胞的毒性.结果 质粒DNA被壳聚糖纳米颗粒高效负载,粒径分布在100～300 nm之间,携带正电荷,被哺乳动物细胞有效摄取并表达,对细胞没有明显毒性.结论 负载DNA的壳聚糖纳米颗粒可用于重组基因疫苗的运送,可用于疾病的预防或治疗.

2019年度国家自然科学基金临床肿瘤研究方向分析及思考

随着细胞生物学等学科的不断发展和深入,肿瘤学基础研究取得了一定进展,肿瘤学科申请项目数量及质量也逐渐提高。本文总结2019年度国家自然科学基金临床肿瘤学科面上项目、青年科学基金项目以及地区科学基金项目的申请与资助情况,并从不同角度深入分析面上项目的研究方向,针对临床肿瘤中非编码RNA、肿瘤免疫治疗、肿瘤微环境、肿瘤代谢等代表性研究方向,以及淋巴管新生、细胞焦亡及铁死亡、溶酶体及线粒体等研究前沿进行综述。

鼻炎冲剂治疗变应性鼻炎的免疫调节机制探讨

目的探讨鼻炎冲剂治疗变应性鼻炎的免疫调节机制。方法选择30例常年性变应性鼻炎患者,予鼻炎冲剂连续口服2月,进行疗效评估;采用流式细胞仪测定20例正常对照组及30例患者组治疗前后外周血单个核细胞的CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+CD25+T细胞比例;同时采用ELISA法测定血清IL-10、IFN-γ的含量。结果治疗组有效率为86.7%;外周血单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+CD25+T细胞比例:治疗组治疗前16.83±2.94%,治疗后19.38±3.71%;对照组20.75±4.64%。血清IL-10含量(pg/ml):治疗组治疗前6.87±1.08,治疗后11.97±1.62;对照组13.18±1.56。血清IFN-γ含量(pg/ml):治疗组治疗前14.77±2.13,治疗后14.56±2.29;对照组15.65±1.93。结论本研究提示鼻炎冲剂可通过提高外周血单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量及血清IL-10含量有效治疗变应性鼻炎。

B7-H1及其受体与肿瘤免疫逃逸

B7 H1是近年来发现的B7家族的一个新成员。B7 H1与相应受体结合后,对T细胞、B 细胞的功能有重要影响。近期研究发现许多肿瘤的细胞表面亦可大量表达B7 H1和相应受体。肿 瘤细胞表达的B7 H1与其受体结合能抑制机体的特异性细胞免疫和体液免疫,参与肿瘤的免疫逃 逸。阻断B7 H1与其受体的结合将是肿瘤治疗的一条新途径。现综述近年来B7 H1与肿瘤免疫逃 逸的研究进展。

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。

胃癌组织中EGFR和COX-2表达的意义及其相关性

目的：探讨表皮生长因子受体（EGFR）和环氧化酶-2（COX-2）的表达与胃癌侵袭、转移因素的关系以及EGFR与COX-2在胃癌组织中表达的相关性．方法：用免疫组化的方法检测61例胃癌组织和相应的20例癌旁组织石蜡切片中EGFR、COX-2表达情况；用Western blot方法检测10例胃癌组织和相应的癌旁组织中EGFR、COX-2蛋白的表达．结果：免疫组化检测胃癌组织中EGFR及COX-2的阳性表达率分别为36．07％、59．02％均明显高于癌旁组织的0％、25％（x^2=9．903，P〈0．01：x^2=6．972，P〈0．01）；COX-2表达与浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和病理分化程度有关（x^2=6．333，P〈O．05；x^2=5．588，P〈0．05；x^2=8．826，P〈0．01；x^2=5．653，P〈0．05）．EGFR表达与淋巴结转移和TNM分期有关（f=10．648，P〈0．01;x^2=4．150，P〈0．05）．EGFR与COX-2表达呈明显相关（r=0．316，P〈0．05）．Western blot方法检测胃癌组织中EGFR及COX-2的蛋白表达高于癌旁组织（35．89±12．50vs15．14±2．15，P〈0．01：51．29±23．42vs27．65±7．42．P〈0．05）．结论：EGFR、COX-2在胃癌组织中高表达，EGFR、COX-2的表达与胃癌的侵袭、转移密切有关，COX-2表达与EGFR显著相关．

bcr-abl基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤的影响

为了研究bcr-abl融合基因疫苗对小鼠SP2/0/bcr-abl移植瘤的影响,采用pVbcr-abl、pVbcr-abl/mIL7两种质粒分别免疫BALB/c小鼠,然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击免疫小鼠,观察疫苗对SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的影响,检验其是否具有免疫保护作用。结果表明用基因疫苗免疫的两个实验组与两个对照组(空白对照组和空载体对照组)相比,在移植肿瘤形成时间、肿瘤表面破溃时间、肿瘤体积、荷瘤生存期等指标上均存在明显差异。pVbcr-abl/mIL7免疫小鼠组的荷瘤生存时间比pVbcr-abl免疫组相对延长。常规病理学分析发现,对照组小鼠的移植瘤组织比较致密,瘤细胞体积较大,形状不规则,而两个免疫组的肿瘤组织较为疏松,肿瘤细胞体积相对较小,并有大量炎性细胞浸润。两个对照组小鼠的肝脏组织内发现有大量肿瘤转移灶,而两个免疫组小鼠则未发现。结论接受bcr-abl基因疫苗免疫的小鼠被诱导产生较强的特异性免疫保护力,对SP2/0/bcr-abl移植瘤的体内生长有一定抑制能力。

稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立

为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×107CFU/ml。结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础。

树突状细胞上调MHCI类相关抗原A表达对NK细胞活性的影响

目的:观察单核细胞、未成熟和成熟树突状细胞(DCs)表达MHCI类相关抗原A(MICA)的情况,以及DCs表达MICA后对NK细胞活性的影响。方法:用流式细胞术分别检测单核细胞、未成熟DC(iDCs)以及LPS、TNF-α、CD40L、IL-15和IFN-α分别刺激的成熟DCs表面MICA的表达,并观察DCs表达MICA后对NK细胞表达CD69、细胞毒活性和分泌IFN-γ的影响。最后用流式细胞术检测重组NKG2D/Fc蛋白和抗IL-12单克隆抗体(mAb)对DCs激活NK细胞的影响。结果:单核细胞不表达MICA,iDCs低表达MI-CA。LPS、TNF-α和CD40L对DCs表达MICA无影响;但IFN-α和IL-15可促进DC上调MICA表达。DCs表达MICA后可促进NK细胞表达CD69、分泌IFN-γ、杀伤K562细胞。NKG2D/Fc蛋白可抑制NK细胞的杀伤活性和分泌IFN-γ;而抗IL-12mAb仅抑制IFN-γ分泌。结论:MICA在DCs表面的表达受局部微环境影响,且DCs表达MICA后可增强NK细胞的活性。

基于CD_(107a)标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立

目的建立基于CD107a标记、利用流式细胞仪检测NK细胞毒性的方法。方法首先将外周血单个核细胞(PBM-Cs)与K562细胞以3∶1比例混合,2 h后加入莫能菌素,1.5 h后加入CD107a和CD56标记抗体,流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果 NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子,效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景,低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。

TNFα-在小鼠叶酸诱导肾病中的致病作用及其机理研究

目的研究TNF-α在小鼠叶酸诱导肾病中的致病作用及其机制。方法建立小鼠叶酸诱导肾病模型,运用抗TNF-α多克隆抗体及对照抗体干预治疗,检测小鼠血清以及肾组织中TNF-α水平,肾小管上皮细胞凋亡情况以及凋亡相关蛋白的表达水平。结果在CD1小鼠叶酸诱导肾病模型中,尿素氮水平显著升高,肾小管上皮细胞坏死和凋亡增加,小鼠血清以及肾组织中TNF-α水平显著升高,肾皮质组织中Bcl-xL表达水平显著下降,运用抗TNF-α多克隆抗体干预治疗可保持Bcl-xL在肾组织中的表达水平,减少肾小管上皮细胞凋亡,有效减轻小鼠肾功能损害。结论TNF-α在小鼠叶酸诱导肾病发病机制中具有重要作用,阻断TNF-α是治疗急性肾衰的一种潜在有效手段。

结肠癌患者单核或树突状细胞MICA的表达及其与NK细胞活性的关联

目的:观察结肠癌患者单核或树突状细胞是否表达MHCⅠ类相关抗原A(MICA),并分析MICA+单核细胞的频率是否与患者体内NK细胞的活性相关联。方法:首先利用流式细胞仪检测MICA在外周血单核细胞和由单核细胞诱导而来树突状细胞(DCs)上的表达;并用IL-15和IFNα-刺激树突状细胞,观察MICA表达的变化;然后检测患者外周血NKG2D+、CD16+、CD69+NK细胞的频率及NK细胞的杀伤活性;最后分析MICA+单核细胞的频率是否与NK细胞表达NKG2D及其杀伤活性关联。结果:与健康个体相比,结肠癌患者MICA+单核细胞的频率无显著变化。未成熟DCs表达MICA,但受IL-15和IFNα-刺激后,结肠癌来源的DCs表面MICA的表达无显著上调。结肠癌患者外周血NKG2D+、CD69+NK细胞的频率显著降低,NK细胞的杀伤活性显著降低,而CD16+NK细胞的频率无明显变化。结肠癌患者MICA+单核细胞的频率与NK细胞表达NKG2D无明显关联,但与NK细胞杀伤靶细胞时CD107a的表达正相关。结论:结肠癌患者体内单核细胞表达MICA与NK细胞表达NKG2D无关,但高频率MICA阳性的单核细胞与NK细胞的抗肿瘤活性正相关。

Bcr-abl融合基因片段的克隆及在原核细胞中的融合表达

目的 :克隆和表达Bcr abl融合基因融合位点周围的基因片段。方法 :以慢性粒细胞白血病 (CML)K5 6 2细胞株总RNA作为模板 ,采用RT PCR方法扩增包含Bcr abl(b3a2 )融合位点周围的基因片段。将RT PCR产物按正确的阅读框架 ,定向克隆进pGEX 6P 1载体谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)的下游 ,将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1菌株 ,以 1.0mmol/LIPTG诱导Bcr abl融合基因片段的表达。结果 :原核细胞融合表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,证实该融合蛋白为 4 2 0 0 0大小。用该表达产物免疫ICR小鼠 ,所制备的抗血清可与K5 6 2细胞特异性结合。结论 :原核细胞表达的p4 2 Bcr abl融合蛋白具有p2 10 Bcr abl融合蛋白的特异抗原性 ,为进一步实验研究奠定了基础。

高能X线照射对肿瘤细胞表达MICA及NK细胞功能的影响

目的探讨肿瘤细胞接受不同剂量高能X线照射后,细胞表面MICA抗原表达及对NK细胞功能的影响。方法分别取T淋巴细胞株T2、结肠腺癌细胞株LS-174-T及食管鳞癌细胞株ECA-109,经0、4、8、163、2 Gy的剂量照射,16 h过夜培养,给细胞标记MICA的单克隆抗体,分析肿瘤细胞平均荧光密度(MFI的变化。并将外周血单个核细胞与经优化剂量照射的肿瘤细胞按10∶1比例孵育,4 h后利用流式细胞术胞内染色法分析NK细胞释放穿孔素的情况以评价NK细胞的杀伤毒性。结果不同肿瘤细胞株上调MICA表达的最佳放疗剂量不同,而肿瘤细胞上调MICA表达后可增强NK细胞的杀伤毒性。结论适宜的放射剂量促进肿瘤细胞表达MICA抗原而增强机体免疫功能。

放疗对食管癌患者血清可溶性MI CA含量及外周血NK细胞功能的影响

目的探讨经不同剂量高能X线照射后食管癌患者血清可溶性MHC—I类分子链相关基因A（sMI-CA）含量、自然杀伤细胞（NK细胞）表面NK细胞2族成员D（NKG2D）受体的表达及其杀伤毒性的变化。方法采用ELISA法检测中晚期食管癌患者（n=28）和正常对照（n=21）血清sMICA的含量，并动态分析6例食管癌患者经不同剂量高能X线照射后血清sMICA含量的变化。采用流式细胞术检测NK细胞NKG2D受体的表达，胞内染色法分析NK细胞杀伤靶细胞功能的变化。结果与正常对照相比，食管癌患者血清sMICA含量明显升高，但不同放疗剂量对食管癌患者血清sMICA含量无显著影响。食管癌患者外周血阳性表达NKG2D的NK细胞比例与正常对照相比显著降低，同时其细胞毒活性亦明显降低。而且与治疗前相比，40～60Gy的放疗剂量时NKG2D阳性的NK细胞数增加，同时其NK细胞毒活性最强。结论放疗对食管癌患者血清sMICA含量无明显影响，但适量放疗可使NK细胞毒活性增强。

固相MHC Ⅰ类相关抗原A刺激的NK细胞对树突状细胞活性的影响

目的:观察固相MHC I类相关抗原A(iMICA)刺激的NK细胞对树突状细胞(DCs)活性的影响。方法:首先取新鲜分离及受固相MICA刺激的异体NK细胞,或IL-2、及IL-2联合iMICA刺激的自体NK细胞与未成熟DCs(iDCs)按5∶1比例孵育24 h后,用流式细胞术(FCM)分析HLA-DR+或CD86+频率的DCs。然后取自体NK细胞以iMICA刺激后,按1∶5的比例与iDCs孵育24 h后,FCM检测DCs上HLA-DR、CD86的表达。最后在NK细胞与DCs的共培养体系中加入抗IFN-γ抗体,观察DCs上HLA-DR、CD86表达的变化。结果:当NK细胞与iDCs孵育比例为5∶1时,异体新鲜分离的与自体活化的NK细胞均能杀伤iDCs;而iMICA无协同作用。当NK细胞与iDCs孵育的比例为1∶5时,iMICA刺激的NK细胞可促进DCs表达HLA-DR和CD86;而加入抗IFN-γ抗体可抑制NK细胞诱导DCs表面HLA-DR和CD86表达的上调。结论:异体新鲜分离的或自体活化的NK细胞杀伤iDCs时,无需iMICA的刺激;但当NK细胞的数目明显低于iDCs时,iMICA可刺激NK细胞分泌IFN-γ促进DCs成熟。

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。

p210^(bcr-abl)抗原的T细胞表位鉴定及其特异性CTL细胞检测

目的:探讨p210bcr-abl抗原的免疫原性,预测并鉴定该蛋白来源的HLA-A2限制性T细胞表位,并在慢性粒细胞白血病患者中检测其特异性CTL细胞分布。方法:首先利用生物信息学软件预测并选取2个p210bcr-abl来源的表位:BCR-ABL642与BCR-ABL926m;T2细胞亲和力实验鉴定短肽与HLA-A2分子的亲和力;然后制备分别锚合这2种表位的可溶性HLA-A2四聚体,流式检测术检测其特异性CTL细胞在CML患者外周血CD8+T细胞中的频率。结果:与健康人群相比,BCR-ABL642和BCR-ABL926m肽表位限制性CTL细胞的频率在CML患者均明显升高(P<0.01);而来自流感病毒短肽的特异性CTL细胞在两个群体中无统计学差异(P>0.05);另外,BCR-ABL642特异性CTL细胞的频率在CML慢性期和急变期之间有统计学差异(P<0.05)。结论:所选2种肽表位均具有免疫原性,可建立基于这2种短肽的免疫治疗措施。

调节性B细胞在肿瘤中的研究进展

调节性B细胞(Breg)是近年来新发现的B细胞功能型亚群,其通过分泌白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-35(IL-35)和转化生长因子-β(TGF-β)等负向调节因子抑制机体免疫应答,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用,影响肿瘤的发展、侵袭和转移。在肝癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌等多种常见癌中均发现存在具有促癌效应的Breg。Breg和肿瘤的临床分期、治疗、预后存在一定的相关性。靶向Breg可能成为未来肿瘤免疫治疗的一个新方向。