综合性大学医学院细胞生物学教学改革实践

就如何提高综合性大学医学院校中细胞生物学的教学质量进行了讨论,从如何合理组织优化教学内容,充分应用现代教学手段和教学方法提高课堂教学效果,开展实践性教学环节的改革,不断提高学生的分析问题和解决问题的能力等方面介绍了细胞生物学教学改革的方法和措施,并就如何进一步提高教学质量、激发学生学习积极性等方面进行探讨。

低氧对人肺腺癌A549细胞迁移和黏附的影响

目的:探讨低氧对人肺腺癌A549细胞迁移以及与血管内皮细胞黏附的影响。方法:细胞划痕实验和Transwell实验检测低氧对A549细胞迁移和浸润的影响;细胞黏附实验检测低氧对A549细胞与血管内皮细胞黏附的影响;免疫荧光法观察低氧对A549细胞中E-cadherin、β-catenin、纤维状肌动蛋白(F-actin)分布的影响;荧光素酶报告基因检测低氧对A549细胞中依赖于缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的转录活性的影响。结果:低氧可以促进A549细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附,影响A549细胞中E-cadherin和β-catenin的分布及F-actin细胞骨架的重排,上调A549细胞中依赖于HIF-1的报告基因的表达。结论:低氧促进A549细胞的迁移、浸润和与血管内皮细胞的黏附可能是通过调控A549细胞中依赖于HIF-1基因的表达,进而影响细胞中E-cadherin和β-catenin分布和F-actin细胞骨架的重排。

不同日龄小鼠卵丘颗粒细胞对卵泡刺激素/缺氧诱导因子-1信号通路的影响

目的研究不同日龄小鼠颗粒细胞对卵泡刺激素(FSH)诱导的缺氧诱导因子-1/血管内皮细胞生长因子(HIF-1/VEGF)信号通路的影响。方法超排卵方法取出卵母细胞和颗粒细胞,进行体外受精;荧光素酶报告基因实验检测常氧和低氧培养条件下,不同日龄小鼠卵丘颗粒细胞对FSH诱导的HIF-1/VEGF信号通路的应答;蛋白质免疫印迹技术检测FSH受体的表达水平。结果雌性小鼠超排卵数和卵母细胞体外受精能力与小鼠日龄数呈负相关;FSH上调小鼠卵丘颗粒细胞HIF-1α的转录活性;免疫印迹结果显示小鼠颗粒细胞中FSH受体的表达水平随着日龄数的增加呈下降趋势。结论小鼠卵丘颗粒细胞对FSH诱导的HIF-1/VEGF信号通路的应答反应随小鼠天日龄数增加而下降,与颗粒细胞表面FSH受体的表达下降相一致。雌性小鼠随着年龄增加引起的生殖能力下降可能与颗粒细胞表面FSH受体表达减少有关。

金雀异黄素对雌性小鼠卵母细胞成熟及其受精能力的影响

目的:探讨金雀异黄素(Gen)对小鼠卵母细胞成熟的影响。方法:用不同浓度的Gen给小鼠腹腔注射后,检测Gen对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)、第一极体(PB1)释放、体外受精和胚胎发育等的影响;用含不同浓度的Gen的培养液培养小鼠未成熟卵母细胞,观察卵母细胞GVBD、PB1释放的发生率;结果:腹腔注射Gen可以增加小鼠子宫湿重,增加小鼠的超排卵数(除高剂量组外)、影响卵母细胞体内成熟过程中的GVBD和第一极体的释放(Gen-0.5组除外),高剂量组小鼠成熟卵母细胞的受精能力和胚胎发育能力均下降。Gen以剂量依赖的方式抑制体外培养小鼠未成熟卵母细胞的GVBD和PB1的释放。结论:Gen能够可逆性地抑制小鼠未成熟卵母细胞的成熟,高剂量的Gen可能影响卵母细胞减数分裂过程,降低卵母细胞的受精能力,提示育龄妇女摄入过量Gen及其化合物可能会导致生育能力降低,甚至造成不育或不孕。

基于转录组测序分析转化生长因子-β1诱导肾纤维化机制

目的:探究转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾纤维化的机制。方法:将TGF-β1处理和未处理的肾成纤维细胞NRK-49F进行转录组测序,采用DESeq2分析测序结果,以错误发现率低于0.05且log2FC绝对值大于1为标准筛选差异表达的基因,并对差异表达的基因进行基因本体(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。进一步筛选差异表达基因中编码转录因子的基因,并利用单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾纤维化模型和高通量基因表达数据库GSE104954数据集对这些基因在肾纤维化过程中的表达进行验证。结果:TGF-β1处理6、12和24 h后,分别有552、1209和1028个差异表达基因。GO分析表明,这些差异表达基因在发育、细胞死亡和细胞迁移过程中显著富集。KEGG分析显示,在TGF-β1诱导早期(TGF-β1处理6 h)主要表现为Hippo、TGF-β、Wnt信号通路的变化,而在TGF-β1诱导晚期(TGF-β1处理24 h)主要表现为细胞外基质受体相互作用、局灶黏附和黏附分子连接等相关通路的改变。在TGF-β1处理6 h时291个上调的差异表达基因中,Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Ahr、Foxo1、Myc、Tcf7、Foxc2、Glis1等13个基因编码转录因子。在细胞模型中验证发现,TGF-β1可以诱导其中9个编码转录因子基因(Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Vdr、Lef1、Myc、Tcf7)的表达,其余4个基因的表达水平在TGF-β1处理后无显著变化。在动物模型验证中发现,Snai1、Irf8、Bhlhe40、Junb、Arid5a、Myc和Tcf7显著上调,而Vdr显著下调,Lef1无显著变化。在GSE104954数据集中验证发现,IRF8在糖尿病肾病患者和IgA肾病患者的肾小管间质中显著高表达,MYC在糖尿病肾病患者中高表达,而其他7个基因的表达产物与对照组相似。结论:TGF-β1诱导肾成纤维细胞基因差异表达,Irf8和Myc可能是慢性肾脏病和肾纤维化的潜在靶点。

AdH1-siRNA-Survivin抗小鼠黑色素瘤生长和转移的研究

目的研究针对Survivin的腺病毒介导的siRNA对小鼠黑色素瘤生长和转移的影响。方法构建表达小鼠Survivin序列特异性siRNA复制缺陷型重组腺病毒(AdH1-siRNA-Survivin),利用Western blot方法检测感染AdH1-siRNA-Survivin的B16BL6细胞中Survivin蛋白的表达;采用皮下注射法建立小鼠黑色素瘤生长模型,采用瘤内或周围多点注射相应的重组腺病毒,每周1次,每次2×109FPU,共3次。定期测量各组肿瘤体积,应用免疫组化法检测肿瘤微血管密度(MVD);采用尾静脉注射感染重组腺病毒的B16BL6细胞建立小鼠肿瘤转移模型,计数并比较各组小鼠肺表面的黑色转移结节数。结果AdH1-siRNA-Survivin可以显著下调B16BL6细胞Survivin蛋白的表达;与空白对照组和空载病毒组(AdH1-Empty)相比,AdH1-siRNA-Survivin注射组显著抑制小鼠肿瘤的生长,降低肿瘤的MVD数(P<0.01);感染AdH1-siRNA-Survivin的B16BL6细胞小鼠的肺转移灶数目也显著降低(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的针对Survivin的siRNA技术有效地下调细胞中Survivin的表达,能减少肿瘤内微血管生成、抑制肿瘤生长和转移。

单极纺锤体1结合蛋白2基因敲除对人肝癌SMMC-7721细胞迁移的影响

目的运用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9基因编辑技术构建敲除人单极纺锤体1结合蛋白2 (hMOB2)的肝癌SMMC-7721细胞,观察hMOB2基因敲除对其迁移的影响.方法首先将靶向hMOB2基因的导向RNA (sgRNA)的CRISPR序列克隆到慢病毒载体lentiCRISPRv2中,并将制备的慢病毒颗粒感染肝癌SMMC-7721细胞,然后使用嘌呤霉素筛选并挑取单克隆进行培养,用蛋白质印迹法(Western blot)方法检测hMOB2基因敲除效果,利用Transwell、细胞划痕迁移实验检测敲除hMOB2基因对SMMC-7721细胞迁移的影响,运用GraphPad Prism 8.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用t检验.结果成功构建了靶向hMOB2基因的慢病毒介导的CRISPR-Cas9编辑/敲除系统,筛选、建立了hMOB2基因稳定敲除的SMMC-7721细胞株,Transwell迁移实验显示,与对照组比较,敲除组中挑选的单克隆sgR-1细胞的迁移数为(224.3±6.3)个,sgR-2细胞的迁移数为(166.3±6.5)个,明显高于对照组[(114.3±10.5)个,t=16.680、9.714,P<0.01],细胞划痕实验结果显示,与对照组比较,sgR-1相对愈合面积为1.61±0.03(t =24.610,P<0.01),sgR-2为1.26 ±0.04(t=8.081,P<0.01).结论敲除hMOB2基因可促进人肝癌SMMC-7721细胞迁移.

长链非编码RNA的免疫调控作用及在类风湿关节炎的研究进展

从1958年Circk提出中心法则，到后来反转录酶的发现，表明非编码序列的存在。这些可以产生稳定转录本的序列称之为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），细胞中含量最多的ncRNA是tRNA和rRNA，还有snRNA，snoRNA，piRNA，microRNA和长链非编码RNA（long non-codingRNA，lncRNA）等。lncRNA是转录本长度超过200nt的非编码RNA，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物。其生物学功能类似于mRNA，但对于特殊的细胞类型，lncRNA能够实现更精密的调控。根据lncRNA与编码基因位置的关系，分为五大类：基因间、基因内、双向、正义及反义lncRNA。通过分析功能性lncRNA的序列，发现具有如下特征：内含子及起始密码子的缺乏、GC含量的低下以及阅读框的开放。此外，一些lncRNA还具有高级结构，对于发挥特异性功能至关重要。2010年，lncRNA引起研究人员的广泛关注，虽已证实lncRNA几乎在基因生命周期的各个阶段，对基因的表达起调控作用，但具体机制尚需探讨。作为生命科学的重要组成部分，医学领域也日益关注lncRNA在疾病进程中发挥的作用。不少证据显示lncRNA涉及免疫功能的调控，现将与toll样受体（toll-like receptor，TLR）、免疫细胞相关的lncRNA及lncRNA在RA的研究进展作以下综述。

金雀异黄素对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠血清骨保护素及核因子-κB受体活化因子配体的影响

目的：研究金雀异黄素（genistein，Gen）对Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型（typeⅡ，CIA）大鼠血清骨保护素（OPG）及核因子-κB 受体活化因子配体（RANKL）的影响。方法采用 SPSS 17.0软件随机抽样分为两组，编号1～10为空白对照组、11～60为造模组。造模组的50只大鼠建立CIA模型。造模成功的大鼠再按上述编号分为模型对照组、低剂量Gen组、中剂量Gen组、高剂量Gen组和甲氨蝶呤（MTX）组，于造模次日开始用药，各Gen组灌胃Gen混悬液1 ml/d；甲氨蝶呤组每周灌胃MTX 1 ml/次，浓度为0.1 mg/ml；空白组、模型对照组每天灌胃等量的生理盐水。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组大鼠血清RANKL及OPG的水平。结果骨代谢因子RANKL在模型对照组大鼠血清中表达量（0.328±0.044）的显著高于空白对照组（0.180±0.029）（P＜0.05）；Gen中、高剂量对RNAKL的抑制作用（分别为0.144±0.017、0.163±0.020）与甲氨蝶呤组（0.139±0.072）相当。模型对照组大鼠血清中的细胞因子OPG的表达水平（0.103±0.013）低于空白对照组（0.268±0.022）（P＜0.05）；Gen中、高剂量对OPG（分别为0.149±0.012、0.145±0.024）的上调作用与甲氨蝶呤组（0.160±0.056）相当。结论 Gen可影响 CIA 大鼠血清中 RANKL、OPG 水平，从而影响 OPG/RANKL 比值。提示 Gen 可能通过RANKL/OPG/RNAK通路抑制RA骨质破坏。