F107(F18_(ab))菌毛单抗的制备、鉴定与初步应用

将大肠杆菌 10 7/ 86和水肿病菌株在TSB中培养 ,鉴定其表达F10 7菌毛 ,前者作为免疫原免疫BABL/C小鼠 ,后者作为检测抗原包装酶标板。细胞融合后经ELISA和玻板凝集检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞株 ,命名为F7_1。该细胞株制备的腹水ELISA效价为 :2 16,试管凝集价为 :1∶5 12 0 ,在免疫印迹中可与提取的F10 7菌毛特异性条带发生反应。利用此单抗检测表明 ,91%的水肿病菌株表达F10

志贺样毒素II型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素II型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT -IIeA在含氨苄青霉素的 2×YTA培养基中培养 ,至对数生长期时加入IPTG诱导 ,诱导的重组菌超声波裂解后 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白 ,测定纯化蛋白的浓度 ,免疫BALB/c小鼠 ,细胞融合后经ELISA检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞 ,命名为A2 _D3 ,制备的单抗腹水ELISA效价为 2 4log2 ,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应 ,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测 13株水肿病菌株 。

致仔猪水肿病大肠杆菌快速检测方法的建立

将水肿病菌株S在TSB培养基中连续传代两次 ,离心后用生理盐水洗涤 ,制成1×108的细菌悬液。菌液倍比稀释 ,分别与适当浓度的F107菌毛单抗作玻板凝集、间接ELISA、斑点 -ELISA试验 ,结果表明 ,当单抗100×稀释时 ,三种方法的细菌最小检出量分别为2.5×107、6×105、1×103,斑点 -ELISA最敏感。从患水肿病的仔猪小肠黏膜上刮取黏液 ,溶于PBS中 ,将此溶液一部分稀释后在麦康凯平板上菌落计数 ,另一部分作为抗原做斑点 -ELISA。结果显示致病菌在小肠黏膜上大量存在 ,斑点 -ELISA能敏感、快速的检测出来。这一检测方法的建立 ,为其它大肠杆菌病的诊断提供了较好的借鉴。

F107(F18ab)菌毛的提取、提纯及鉴定

将致仔猪水肿病菌株107/86在TSB、TSA培养基上传代,使之表达F107菌毛,大量收集菌毛化的细菌,利用热洗脱法提取菌毛。粗提菌毛经15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一条约15ku的条带,以染色的凝胶为对照,将未染色凝胶上的菌毛条带切下,捣碎,加生理盐水,37℃,2h后离心,吸出上清再次电泳,可见提纯的菌毛条带。用针对F107菌毛的单抗做免疫印迹反应,证实此条带为F107菌毛蛋白。