通关藤联合XELOX方案促进人结直肠癌HCT116细胞双硫死亡的作用

目的探讨通关藤联合XELOX方案对人结直肠癌HCT116细胞双硫死亡的作用及相关机制。方法体外培养结直肠癌HCT116细胞,分别用0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8μg/ml浓度的卡培他滨,0、10、20、40、80、160μg/ml浓度的奥沙利铂,0、15、30、60、120、240 mg/ml浓度的通关藤,0、4、8、16、32、64μg/ml浓度的葡萄糖抑制剂BAY-876处理HCT116细胞;以及经25μg/ml BAY-876预处理后再经以上各药物、各浓度处理HCT116细胞。将HCT116细胞分为阴性对照组(不做任何处理)、卡培他滨组(4.0μg/ml)、奥沙利铂组(90μg/ml)、通关藤组(140 mg/ml)、XELOX方案组(4.0μg/ml卡培他滨+90μg/ml奥沙利铂)、通关藤联合XELOX方案组(140 mg/ml通关藤+4.0μg/ml卡培他滨+90μg/ml奥沙利铂)。BAY-876处理组为以上各组别中,每组加入葡萄糖抑制剂BAY-87625μg/ml。采用MTT法检测细胞增殖情况,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,邻甲苯胺法检测葡萄糖浓度,NADPH比色法检测NADPH水平,胱氨酸摄取荧光法检测胱氨酸荧光强度,半胱氨酸比色法检测半胱氨酸含量。结果经0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8μg/ml浓度卡培他滨,0、10、20、40、80、160μg/ml浓度奥沙利铂,0、4、8、16、32、64μg/ml浓度BAY-876,以及经25μg/ml葡萄糖抑制剂BAY-876预处理后再经上述各药物、各浓度处理HCT116细胞后,细胞存活率差异均有统计学意义(F=644.60,P<0.001;F=417.30,P<0.001;F=1028.00,P<0.001;F=1066.00,P<0.001;F=847.70,P<0.001),且随着各药物浓度增加,HCT116细胞活性均逐渐下降(均P<0.05);经0、15、30、60、120、240 mg/ml浓度通关藤,以及经25μg/ml葡萄糖抑制剂BAY-876预处理后再经上述浓度药物处理HCT116细胞后,细胞存活率差异均具有统计学意义(F=107.50,P<0.001;F=619.70,P<0.001),且随着药物浓度增加,HCT116细胞活性呈现先上升后下降的趋势(均P<0.05)。AnnexinⅤ-FITC/PI双染法结果显示,阴性对照组绿色、红色、黄色荧光强度均较弱,各用药组绿色荧光与红色荧光的表达增强,其中卡培他滨组红色荧光、黄色荧光占比较大;奥沙利铂组及通关藤组绿色荧光占比较小;XELOX方案组的绿色荧光和黄色荧光占比多于卡培他滨组及奥沙利铂组;通关藤联合XELOX方案组绿色荧光、红色荧光占比最大。经葡萄糖抑制剂BAY-876预处理后,各组细胞中绿色、黄色荧光均明显增多,其中,卡培他滨组和奥沙利铂组的绿色荧光、黄色荧光明显增多;XELOX方案组的3种荧光明显多于卡培他滨组和奥沙利铂组;通关藤联合XELOX方案组,3种荧光占比最大。阴性对照组、卡培他滨组、奥沙利铂组、通关藤组、XELOX方案组、通关藤联合XELOX方案组以及经葡萄糖抑制剂BAY-876处理HCT116细胞后以上各组的葡萄糖浓度分别为(19.91±0.13)、(22.82±0.88)、(11.87±0.14)、(17.93±0.14)、(10.53±0.10)、(7.56±0.08)μg/ml,(11.44±0.10)、(11.73±0.72)、(8.98±0.40)、(14.25±0.33)、(6.77±1.50)、(1.56±0.17)μg/ml,差异均有统计学意义(F=762.60,P<0.001;F=118.80,P<0.001);与无处理的各组相比,经葡萄糖抑制剂BAY-876处理HCT116细胞后的细胞内葡萄糖浓度均显著降低(t=86.50,P<0.001;t=16.90,P<0.001;t=11.83,P<0.001;t=17.79,P<0.001;t=4.35,P=0.012;t=54.34,P<0.001)。各组NADPH水平分别为(131.80±2.61)、(93.87±1.00)、(136.50±3.69)、(105.70±0.84)、(146.90±2.94)、(105.00±2.25)nmol/gProt,(92.33±0.23)、(88.63±0.31)、(97.33±2.02)、(81.77±1.33)、(102.80±1.61)、(85.13±0.45)nmol/gProt,差异均有统计学意义(F=225.60,P<0.001;F=125.50,P<0.001);与无处理的各组相比,经葡萄糖抑制剂BAY-876处理HCT116细胞后的细胞内NADPH水平均显著降低(t=26.11,P<0.001;t=8.62,P<0.001;t=16.13,P<0.001;t=26.38,P<0.001;t=22.78,P<0.001;t=14.97,P<0.001)。各组胱氨酸荧光强度分别为607.30±8.76、655.70±6.57、647.10±19.35、737.80±6.34、756.00±8.65、846.60±11.70,929.60±6.88、1049.00±22.35、1021.00±29.49、1094.00±16.17、1137.00±10.08、1230.00±46.57,差异均有统计学意义(F=188.00,P<0.001;F=48.32,P<0.001);与无处理的各组相比,经葡萄糖抑制剂BAY-876处理HCT116细胞后的细胞内胱氨酸荧光强度均显著升高(t=50.09,P<0.001;t=29.26,P<0.001;t=18.34,P<0.001;t=35.53,P<0.001;t=49.66,P<0.001;t=13.83,P<0.001)。各组半胱氨酸含量分别为(457.00±30.69)、(581.20±30.69)、(326.40±5.49)、(374.20±5.54)、(565.30±5.54)、(246.80±30.69)μmol/L,(100.30±16.57)、(472.90±19.10)、(262.70±28.65)、(348.70±9.55)、(533.40±11.03)、(30.23±5.49)μmol/L,差异均有统计学意义(F=110.00,P<0.001;F=423.50,P<0.001);与无处理的各组相比,经葡萄糖抑制剂BAY-876处理HCT116细胞后的细胞内半胱氨酸含量均显著降低(t=17.71,P<0.001;t=5.19,P=0.006;t=3.78,P=0.019;t=4.00,P=0.016;t=4.47,P=0.011;t=12.03,P<0.001)。结论通关藤联合XELOX方案可通过双硫死亡程序促进人结直肠癌HCT116细胞的死亡。