大鼠脊髓损伤动物模型的建立

目的:建立一个稳定、损伤程度适中的脊髓损伤大鼠模型的技术及方法学特征。方法:实验于2004-09/2005-01在承德医学院临床技能实验室完成。选取30只Wistar大鼠,体质量230～260g,纵行切开大鼠背部皮肤及皮下组织,剥离棘突旁肌肉,切除T7棘突及椎板,暴露脊髓硬膜。根据打击物(重10g)调节高度的不同将30只大鼠分为3mm高度组、5mm高度组、8mm高度组,每组10只。高度使重物自然下落,打击T7段脊髓,迅速移开打击重物及打击头,逐层缝合伤口,喂养8周后行病理学检查。选取通过脊髓最大径的切片在低倍镜下进行显微摄影,照片上侧量并计算空洞或瘢痕的最大直径与同水平脊髓直径的比例。结果:纳入大鼠30只,死亡5只,存活率83.3%;其中3mm高度组死亡1只,5mm高度组死亡1只,8mm高度组死亡3只。3mm高度组3例标本镜下可见损伤段脊髓中有不规则的空腔,6例标本于脊髓内形成不规则瘢痕,损伤部位瘢痕最大直径与同水平脊髓直径比例为(10.0±5.2)%;5mm高度组9例镜下均可见损伤段脊髓中有一个长圆形或不规则的空腔,损伤部位瘢痕最大直径与同水平脊髓直径比例为(46.0±3.8)%;8mm高度组存活的7例镜下均可见损伤段脊髓全部中断,形成瘢痕与硬膜外组织分界不清。结论:5mm高度组存活的大鼠的脊髓均产生位于脊髓中央部或近中央部的空洞,损伤的位置和程度较恒定,是较为理想的损伤模型。

深低温保存大鼠胚胎脊髓组织:以细胞核质比例评价细胞形态和存活率的变化

目的:胚胎细胞脊髓内移植是判定冻存细胞最直接的证据。通过计算机图像处理系统判定细胞核质比例,以观察经深低温保存后大鼠胚胎脊髓细胞形态和存活率的变化。方法:实验于2004-12/2005-03在承德医学院临床技能实验室完成。剖腹取胎龄14d Wistar大鼠的胎鼠,分离胚胎脊髓,剪成1mm3的小块。将DMEM细胞培养液70mL、大鼠灭活血清20mL、DMSO10mL混合制成冻存液。取冻存管,加入冻存液10mL,并将剪好的胚胎脊髓组织10～20块放入其中,封口。放于冰箱中逐步降温保存,最后置于液氮中保存。胚胎脊髓在液氮中保存15d后,取出冻存管,放入37℃恒温水浴槽中快速复温,待完全融化后,以3000r/min离心3min,弃去上清液,再加入等量DMEM细胞培养液,静置3min,冲洗,并植入正常大鼠脊髓内。以台盼蓝拒染率测定深低温保存前和深低温保存后胚胎脊髓组织细胞存活率,着色的为死亡细胞、不着色的为存活细胞。算出细胞存活率和核质比例。4周后应用免疫组化法检测受体大鼠移植段脊髓。结果:①经低温保存的胚胎脊髓细胞存活率低于未经低温保存组[(64.78±6.14)%,(50.07±7.58)%,P<0.01];两组的存活细胞形态和核质比无明显改变。②移植后4周,有1只大鼠因感染死亡。镜下观察移植大鼠脊髓组织均可见移植物存活,存活移植物与受体脊髓组织融合良好,移植区边缘均有少量宿主神经细胞空泡变性,2只因移植物与受体之间存在裂隙,只有部分融合,无明显胶质瘢痕,1只移植区外偶见局限淋巴细胞浸润。③免疫组化检测显示,在移植区内可见少量的5羟色胺及神经丝阳性细胞和纤维,在损伤腔边缘部可见大量来自宿主的5-羟色胺阳性纤维进入移植区,移植区周边的纤维较中央部位纤维粗大。结论:经过深低温保存大鼠胚胎脊髓组织保持了原有的细胞形态,并能够在异体脊髓内存活,并与宿主融合良好,保持了原有的活性。