生物技术专栏导读

世界进入了大科学时代,生命科学基础研究的重大突破通常都是伴随着颠覆性的、重大创新性的生物技术的出现而产生。技术的进步需要基础理论的指导,基础理论的建立发展同样需要技术方法作为手段。近年来,从分子水平到组织器官水平的研究都取得了一系列的重要进展和突破。

RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰:旧貌新颜

细胞内存在多种类型的RNA分子,在调控细胞进程中各自发挥着重要的作用。RNA修饰是在RNA分子上添加化学基团,修饰基团可以改变RNA稳定性、结构和功能,RNA修饰使RNA的功能和作用具有多样性。在氧化应激条件下,8-羟基鸟嘌呤是一种标志性的RNA氧化修饰形式。RNA的结构与功能都可能会受到8-羟基鸟嘌呤修饰的影响,RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰发生可以通过诱导RNA链断裂、碱基脱落等方式影响RNA的结构与功能。研究表明,RNA中8-羟基鸟嘌呤修饰水平可以作为疾病发展的评估指标。随着RNA修饰研究的深入,对RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的研究也日益受到重视。本文主要对RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的生成、RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰的生物学功能、RNA 8-羟基鸟嘌呤修饰修复调控相关蛋白质分子、8-羟基鸟嘌呤修饰RNA分子检测技术,以及RNA 8-羟基鸟嘌呤与神经性疾病和癌症等疾病的关系研究进展进行综述,旨在为RNA修饰的生物学功能和8-羟基鸟嘌呤修饰RNA在疾病中的潜在作用研究提供思路和启示。

黄芪甲苷对肝细胞放射损伤预防作用的机制研究

本文研究了黄芪甲苷(Astragaloside IV,ASIV)对肝细胞放射损伤防护的机制。以γ射线照射L-02细胞建立辐射损伤模型,分为对照组、黄芪甲苷组(80μg/mL)、照射组(4 Gy)、黄芪甲苷+照射组(80μg/mL+4Gy),于照射前12 h更换含有黄芪甲苷浓度为80μg/mL的培养基。采用流式细胞术检测黄芪甲苷对照后L-02细胞早期凋亡率及细胞周期的影响;以罗丹明123荧光探针检测黄芪甲苷对照后L-02细胞线粒体膜电位改变的影响;免疫荧光法观察γH2AX焦点数;通过Western Blot检测细胞中Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表达变化。结果显示:照后细胞凋亡率随着药物浓度的增加而降低,黄芪甲苷能有效的缓解电离辐射引起的细胞G2期阻滞;黄芪甲苷+照射组细胞线粒体膜电位均高于照射组;黄芪甲苷+照射组γH2AX焦点数明显少于照射组;照射组细胞内Nrf2、HO-1及NQO1表达升高,黄芪甲苷+照射组Nrf2、HO-1及NQO1表达则是随着药物浓度增加而降低。综上可知,黄芪甲苷对L-02细胞具有辐射损伤预防作用,其机制可能是通过Nrf2途径来减轻电离辐射所致的损伤。

血管生成素与tRNA片段化

t RNA主要功能是转运氨基酸参与蛋白质合成,在蛋白质生物合成过程中起着关键性的作用.近年来发现,t RNA是细胞内小RNA分子的重要来源,具有其它重要的生物学功能.来源于成熟t RNA分子的t RNA片段根据切割位置及生成机制的不同,主要分为两类:一类是t RNA半分子(t RNA halves);另一类是较小的t RNA片段,称为t RFs(t RNA fragments).在哺乳动物细胞中,t RNA半分子由血管生成素在t RNA分子反密码环处切割生成.本文主要针对t RNA半分子的加工机制、功能及在临床上的潜在应用进行综述.

利用CRISPR/Cas系统构建在XRCC6内源基因插入Flag标签序列的HeLa细胞系

目的:利用CRISPR/Cas系统在XRCC6基因5′端插入Flag标签序列,筛选XRCC6-Flag稳定表达的宫颈癌细胞(He La)株。方法:根据Gen Bank中XRCC6基因序列,设计XRCC6基因敲入的g RNA序列,构建入p Cas-Guide载体中,获得p Cas-XRCC6载体;设计XRCC6基因的同源臂序列,利用搭桥PCR方法将同源臂和Flag标签序列作为模板进行扩增,得到供体DNA片段,并将其克隆到p Back Zero-T表达载体上,获得p XRCC6-Donor载体;将上述2个载体共转染He La细胞,采用PCR、Western印迹等方法检测和筛选Flag标签序列插入XRCC6基因5′端的细胞株。结果:构建了p Cas-XRCC6和p XRCC6-Donor载体,筛选获得3株XRCC6-Flag稳定表达细胞株。结论:构建了XRCC6-Flag稳定细胞株,为研究XRCC6基因及其蛋白产物的生物学功能奠定了基础。

辐射诱导的染色质拓扑关联结构域层级变化及其在细胞辐射响应中的作用

基因组三维结构在基因表达调控中发挥重要作用,染色质拓扑关联结构域(topologically associated domain,TAD)是DNA复制和基因转录的基本功能单位,也是DNA损伤修复的功能单元,在辐射诱导的DNA损伤修复中发挥重要作用。近期研究表明,TAD并非是完全独立的结构单元,其内部常呈现多层级结构,对基因表达具有重要调控作用。为探究TAD多层级结构在细胞辐射响应中的作用,本研究使用TAD层级结构识别算法OnTAD对Gene expression omnibus数据库中5Gy X射线照射的淋巴细胞、成纤维细胞和毛细血管扩张性共济失调突变(ataxia telangiectasia mutated,ATM)基因缺陷的成纤维细胞,共26个样本的Hi-C(high-through chromosome conformation capture,Hi-C)数据进行分析,发现辐射后细胞的TAD层级结构出现规律性变化,高层级TAD缺失较多,低层级TAD相对保守;辐射诱导的TAD层级结构变化通过调节基因表达参与细胞辐射响应;ATM是辐射诱导TAD层级结构变化和恢复的重要因子。本研究为从TAD多层级结构角度理解基因组三维结构在细胞辐射响应中的作用提供了新思路。

上皮间质转化在放射性肺纤维化中的作用及治疗策略

放射性肺纤维化(radiation-induced pulmonary fibrosis,RIPF)是核辐射事故、骨髓移植预处理及胸部肿瘤放疗后最严重的晚期并发症之一,其形成过程十分复杂,发病机制也尚未完全阐明。近年来研究发现,电离辐射诱导肺上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是RIPF发生发展的关键环节。本文对电离辐射诱导肺EMT在RIPF发生发展中的作用及以EMT为潜在治疗靶点的相关药物做一综述,为今后研发RIPF的治疗药物提供思路。

电离辐射诱导人肠上皮细胞焦亡机制

目的探讨消皮素E(GSDME)介导的细胞焦亡参与辐射诱导的肠损伤分子机制及消皮素(GSDM)蛋白家族是否通过通用的信号通路调控细胞焦亡。方法利用人正常结肠上皮NCM460细胞和人结肠癌HT-29细胞辐射不同剂量及辐射后不同时间,通过观察焦亡小泡、细胞存活、焦亡执行蛋白的切割进行焦亡指标的检测,对HT-29细胞过表达GSDME并辐射后通过RNA测序技术,对焦亡相关差异基因进行富集分析,筛选相关通路差异基因进行验证。结果辐射诱导NCM460细胞发生显著的细胞焦亡,HT-29细胞过表达GSDME后辐射诱导GSDME激活发生显著的细胞焦亡。成功模拟人肠细胞焦亡状态,过表达GSDME-N和GSDMD-N具有超过50%的焦亡状态下的差异基因;测序分析显示,焦亡状态下的基因主要富集在免疫反应、炎症反应和Rap1信号通路等。结论GSDME激活介导了辐射诱导肠细胞焦亡的发生,GSDM蛋白家族通过通用的调控模式参与细胞焦亡,辐射通过免疫反应、炎症反应和Rap1信号通路诱导GSDME/D激活调控细胞焦亡。

宫颈癌细胞放射损伤后IER5蛋白表达及其相互作用蛋白的筛选和验证

的 了解IER5蛋白经放射损伤后的表达变化,并筛选IER5蛋白在放射损伤后可能参与DNA损伤修复通路中的相互作用蛋白.方法 HeLa细胞经4 Gyγ射线照射后在不同时间点收集细胞,提取总蛋白质和细胞核蛋白行Western blot检验;构建3×Flag标签融合表达的IER5蛋白表达载体,转染人肾上皮细胞293T并照射,收集细胞行免疫沉淀富集IER5的结合蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离免疫共沉淀复合物,考马斯亮蓝染色观察差异条带并切胶酶解后行质谱分析,对可能相互作用蛋白结果进行Western blot验证.结果 IER5蛋白照后4h表达逐渐增加,12 h至高峰,持续至48 h;细胞核内IER5蛋白表达也有增加趋势;质谱分析数据表明,照射组检测出374个蛋白,对照组检测出256个蛋白,两组比较差异蛋白41个,照射组中包括与DNA结合、代谢、损伤修复相关的10个蛋白;其中,与DNA损伤修复密切相关的1型聚ADP核糖基化聚合酶（PARP1）得到Western blot验证.结论 IER5是放射损伤相关蛋白,其可能参与DNA损伤修复通路.

RNA结构与生物信息和记忆

RNA结构具有多样性,RNA功能依赖于RNA结构,RNA结构承载着重要的生物信息。在人脑中,RNA结构可能承载着记忆信息编码的重要功能。对RNA结构作为生物信息的载体和人脑中记忆信息的载体,特别是瞬时记忆信息编码的载体进行了探讨。该假说的提出对阐释记忆的分子机制具有重要意义。

DNA依赖蛋白激酶催化亚基抑制剂NU7026对结肠癌HCT116癌干细胞的放射增敏作用

目的 以结肠癌细胞HCT116为研究对象,评价DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）抑制剂NU7026对癌干细胞的放射增敏作用及其机制。方法 以CD133＋/CD44＋为标志物,流式细胞术检测癌干细胞亚群。将HCT116细胞分为对照组、单纯药物（20 μmol/L NU7026）组、单纯照射（2 Gy γ射线）组和药物＋照射（20 μmol/L NU7026联合2 Gy γ射线）组,照射前2 h加入NU7026。细胞集落形成实验检测HCT116细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡, γ-H2AX foci的免疫荧光激光共聚焦分析DNA双链断裂损伤修复。结果 体外培养HCT116细胞中CD133＋/CD44＋癌干细胞亚群比例高达（88.14±0.47）%,HCT116细胞低密度接种无血清培养基中集落形成率为（84.75±1.35）%。与单纯照射组比较,药物＋照射组细胞存活率显著降低（t=7.22,P〈0.01）。受照后48 h,药物＋照射组的癌干细胞亚群比例较单纯照射组显著降低（t=9.55,P〈0.01）。受照后24 h,NU7026明显增加G2/M期阻滞（t=7.67,P〈0.01）,48 h细胞早期凋亡发生率也明显增加（t=8.24,P〈0.05）。药物＋照射组在照后2、4、8和24 h DNA双链断裂（γ-H2AX foci）残留比单纯照射组明显增多（t=19.58、11.95、7.01和9.45,P〈0.01）。结论 NU7026对癌干细胞为优势亚群的结肠癌HCT116细胞具有明显的放射增敏作用,显著增加对癌干细胞的杀伤效应,增敏机制包括抑制DNA修复,诱发不可逆G2/M期阻滞和增加细胞凋亡。

TGF-β1在放射性肺损伤中的促纤维化作用及其机制

转化生长因子β1(TGF-β1)是一种重要的成纤维细胞因子,其表达水平能反映肺纤维化的严重程度。放射性肺损伤(RILI)包括早期的放射性肺炎(RP)和晚期的放射性肺纤维化(RIPF)。RP向RIPF发展的过程中伴随着TGF-β1表达水平的升高。了解及掌握TGF-β1在RP和RIPF发生、发展过程中的分子机制,对于RILI的防治具有重要意义。笔者就TGF-β1在RILI发生过程中的促纤维化作用及其机制进行综述。

利用CRISPR/Cas9系统建立长链非编码RNA SNHG1基因敲除细胞系并研究其功能

目的利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建长链非编码RNA(lncRNA)核仁小分子RNA宿主基因1(SNHG1)稳定敲除的A549细胞系,并进行功能研究。方法设计靶向SNHG1基因的小向导RNA(sgRNA),将其克隆到LentiCRISPR v2质粒中,构建Cas9‐sgSNHG1质粒。以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增5′同源臂(5′Arm)和3′同源臂(3′Arm)序列,以pEGFP‐Blast质粒为模板,PCR扩增pEGFP‐Blast‐polyA序列;利用重叠PCR将3个序列连接为5′Arm‐pEGFP‐Blast‐polyA‐3′Arm,通过Gibson克隆将其连接到pUC18质粒上,构建SNHG1同源重组模板质粒。将构建成功的两个重组质粒共转染A549细胞,用杀稻瘟菌素(Blast)筛选稳定插入pEGFP‐Blast‐polyA的细胞株,挑取单克隆。实时荧光定量PCR(qPCR)检测敲除效率,CCK‐8法和克隆形成实验检测细胞增殖活力及克隆形成能力。结果成功构建Cas9‐sgSNHG1及SNHG1同源重组模板质粒,筛选获得敲除效率较高的A549细胞系,发现敲除SNHG1可抑制A549细胞增殖活力及克隆形成能力。结论SNHG1稳定敲除的A549细胞系构建成功,SNHG1的癌基因功能受到显著抑制。CRISPR/Cas9介导的同源定向修复可有效抑制长链非编码RNA的表达,是长链非编码RNA功能研究的重要工具。

ATM氧化激活及其在氧化应激中的作用

毛细血管扩张性共济失调突变(ATM)基因编码的ATM蛋白分子作为一种调节细胞氧化应激反应的重要因子,其作用是维持体内氧化还原稳态。该文对氧化应激激活ATM蛋白的关键机制,ATM氧化激活在维持细胞氧化还原稳态、细胞代谢、细胞自噬中的作用及其与疾病的关系进行综述,为深入研究ATM生物学功能及其在相关疾病治疗方面应用提供新思路。

SARS⁃CoV⁃2非结构蛋白16研究进展

在新型冠状病毒(SARS⁃CoV⁃2)感染过程中,病毒编码的非结构蛋白(NSP)在宿主细胞内先于病毒RNA产生,首先形成复制⁃转录复合体,SARS⁃CoV⁃2基因组依赖复制⁃转录复合体得以在宿主细胞内完成正常复制。该文对在SARS⁃CoV⁃2感染早期出现并参与病毒RNA合成的非结构蛋白16(NSP16)的结构和生物学功能及其药物研究进展进行综述,为SARS⁃CoV⁃2引发疾病的预防和治疗提供新思路。

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA—PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit，DNA—PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法通过酵母双杂交技术，以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵，在人肝组织酵母文库中筛选与DNA—PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白，对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析；构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体，分别转染至人胚。肾293T细胞中，检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达；最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中，通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆，通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆，对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白，经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体，且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA—PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论成功筛选到与DNA—PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。

利用CRISPR/Cas方法建立RNaseL基因稳定敲除细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术建立人RNase L基因稳定敲除的细胞株。方法根据Gen Bank中RNase L基因序列,设计RNase L敲除的小指导RNA(sgRNA)序列,将其克隆到p Cas-Guide真核表达载体中,获得p Cas指导RNA(gRNA)载体;设计供体DNA的同源臂序列,通过搭桥PCR将左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂扩增成为一条片段作为同源重组的修复模板,并将其克隆到p Back Zero-T表达载体上,获得p Back Zero-T-RNase LK载体。将上述两个载体共转染HEK293细胞,用潮霉素B筛选,通过Western印迹和DNA测序等技术验证RNase L从基因组上敲除。结果与结论成功构建了载体p Cas-gRNA和p Back Zero-T-RNase LK,Western印迹和DNA测序结果表明,成功获得5株RNase L缺失的细胞株,为探讨RNase L的生物学功能和研究其分子机制奠定了基础。

100 MeV质子照射对肿瘤细胞线粒体氧化损伤及其作用机制研究

目的研究100 MeV质子照射对人宫颈癌HeLa细胞线粒体氧化损伤及其作用机制。方法采用中国原子能科学研究院100 MeV强流质子回旋加速器照射人宫颈癌HeLa细胞,剂量率为0.8 Gy/min。按照射剂量分为未照射组(0 Gy)、低剂量照射组(0.5 Gy)和高剂量照射组(8 Gy),分别于照射后24、48和72 h采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡变化;DCFH-DA标记法检测照射后12~72 h活性氧(ROS)含量动态变化;线粒体呼吸链复合体Ⅰ检测试剂盒检测照射后24和48 h线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性;mRNA芯片杂交检测分析8 Gy质子照射12和24 h后HeLa细胞的差异表达基因。结果与未照射组相比,低剂量照射组细胞增殖、细胞凋亡、ROS生成以及线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性均无明显改变。高剂量照射组在照射后72 h细胞增殖显著降低;24、48和72 h细胞凋亡呈时间依赖性增加;细胞ROS含量在照射后16~24 h明显增加,36 h后逐渐下降;照射后24和48 h,细胞线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性降低。KEGG分析提示,8 Gy质子照射24 h后诱导表达差异变化明显的基因主要集中在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、PI3K/Akt信号通路和过氧化物酶体增殖物(PPAR)激活受体信号通路等。结论100 MeV质子高剂量照射可抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖,促进凋亡,且此改变可能与细胞氧化应激和线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性受到抑制有关。

长链非编码RNA ZEB1-AS1上调肿瘤细胞SGC-7901和NCI-N87受体酪氨酸激酶c-MET蛋白表达水平

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)ZEB1-AS1在肿瘤细胞中与受体酪氨酸激酶c-MET的作用关系。方法在胃癌SGC-7901和NCI-N87细胞中转染pcDNA3.0-ZEB1-AS1质粒,采用CCK-8实验检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹法分析其对c-MET mRNA和蛋白质表达水平的影响。结果 lncRNA ZEB1-AS1促进胃癌SGC-7901和NCI-N87细胞增殖,对细胞周期和凋亡无明显影响;过表达lncRNA ZEB1-AS1上调SGC-7901和NCI-N87细胞中受体酪氨酸激酶c-MET蛋白水平。结论 lncRNA ZEB1-AS1与原癌基因受体酪氨酸激酶在肿瘤细胞中存在相互调控的关系,为阐明受体酪氨酸激酶的机制提供了新线索。

应用高通量测序技术分析小单链RNA分子在血清中的稳定性

目的通过小单链RNA高通量测序方法分析小单链RNA分子在血清中的稳定性,为获得研发小RNA药物的序列特点提供基础。方法人工合成21nt随机序列小单链RNA分子库,用血清孵育后回收小单链RNA分子,进行高通量RNA测序,对测序结果进行比较分析。结果与结论人工合成的不同序列小单链RNA分子在血清中存在稳定性差异,稳定性小单链RNA分子呈现出碱基偏性和基序特征。上述结果将为小RNA分子药物设计和筛选提供参考。