C-末端残基Arg缺失的D-海因酶的分子形式与稳定性

报道D-海因酶分子C-末端Arg残基的缺失,导致酶的解聚与稳定性的显著改变。用基因克隆、表达与纯化的方法,制备了重组D-海因酶(P479)及其C-末端残基Arg缺失的D-海因酶(P478)。SDS-PAGE和Native-PAGE分析表明,在完全相同的条件下,两者单体的分子量相同;但天然P479为二聚体,而P478为单体并保持约40%催化底物海因的活性。突变酶P478的pH值稳定性显著增加,抗SDS能力亦有所提高,但热稳定性明显降低。结果预示:D-海因酶的C-末端残基Arg显著影响酶的分子形式及热稳定性,虽也影响酶活性,但非酶活性所必需。

微生物来源碱性蛋白酶活性提高策略的研究进展

碱性蛋白酶是工业上应用广泛的一类重要的蛋白酶制剂。目前国内高端洗涤用碱性蛋白酶主要依赖于进口,制约国内高端洗涤用蛋白酶的其中一个因素就是酶活性不高。从微生物菌株改造、蛋白质工程,以及通过优化启动子或信号肽的方式调控碱性蛋白酶的表达等3个方面阐述了提高微生物碱性蛋白酶酶活性的策略,最后对未来如何提高微生物来源的碱性蛋白酶活性的前景做了展望。

2,3-吡啶二甲酰亚胺及其工程菌转化产物的高效液相色谱检测

建立了利用含D-海因酶的基因工程菌转化吡啶二甲酰亚胺(PDI)生成3-氨基甲酰基-α-吡啶甲酸(α-3CP)的高效液相色谱(HPLC)检测方法。将工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)诱导表达后收集菌体,以PDI为底物,37℃摇床反应30 min后,以13 000 r/min离心,取上清液进行HPLC检测。色谱条件:HypersilTMGOLD C18色谱柱(250mm×4.6 mm,5μm);流动相为H2O-乙腈(体积比为90∶10,含0.1%(体积分数)三氟乙酸);检测波长为254 nm。当底物PDI达到饱和浓度时,测得工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)的比活力为0.61 U/(mL·10OD600 nm)。该研究为今后利用生物法制备复杂半酰胺有机物提供了坚实的理论基础。

集胞藻PCC 6803中Sll0875蛋白参与调控光系统Ⅰ活性的生物功能研究

叶绿醌是由1个萘醌环和1个半不饱和植基侧链组成的一类光系统Ⅰ(photosystemⅠ,PSⅠ)特有的辅因子。目前,在蓝藻中对其生物合成途径的研究主要集中在萘醌环的形成方面,而对其植基侧链的合成尚缺乏相关报道。本研究通过与近期在拟南芥中发现的1种催化植基单磷酸形成植基二磷酸的激酶(VTE6)进行同源序列比对,在集胞藻PCC 6803中发现1个与之高度同源的蛋白质Sll0875。研究发现,在Sll0875缺失突变体中,叶绿醌和生育酚的含量缺失,叶绿素的含量降低(P<0.05),且该突变体在无葡萄糖培养基中生长迟缓。进一步利用叶绿素荧光、P700氧化还原动力学、77K低温荧光光谱和免疫印迹分析等方法分析了该蛋白质的缺失对PSⅠ功能的影响。研究表明,在突变体Δsll0875中,PSⅠ活性下降,PSⅠ亚基含量与野生型相比显著降低(P<0.01)。这一结果表明,叶绿醌的缺失影响了PSⅠ复合物的累积,导致PSⅠ功能受损,从而影响了蓝藻正常的生长和发育。本研究在蓝藻中证实植醇磷酸化途径对叶绿醌合成的重要性,为进一步研究蓝藻中叶绿醌在PSⅠ复合物的合成、组装和稳定等过程中的作用奠定基础。

不同分子指标鉴定四川雅江鸡蛋菌的差异

以采自四川雅江的一株野生鸡蛋菌作为研究材料,利用CTAB法提取基因组DNA,然后利用PCR技术分别扩增ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α等DNA序列相应区段,并连接到T载体上进行DNA测序;利用GenBank核酸数据库对测序得到的不同序列进行同源比对,并从GenBank检索获取相似序列,与测序得到的不同序列分别构建系统发育树。结果揭示,以ITS和LSU序列分析鉴定该野生菌为肉桂鹅膏菌(Amanita cinnamomescens),而以RPB2、β-tubulin和EFI-α序列分析鉴定结果为红黄鹅膏黄褐变种(Amanita hemibapha var.ochracea);最后综合ITS、LSU、RPB2、β-tubulin和EFI-α序列分析和结合形态学观察,将四川雅江鸡蛋菌鉴定为红黄鹅膏黄褐变种(Amanita hemibapha var.ochracea)。在鸡蛋菌的分类鉴定中应考虑更多的分子指标,不能以单一的ITS和LSU序列作为单一的标准。

沥青基炭材料:结构设计、制备方法及其在储能中应用

沥青具有炭含量高、易石墨化的特点,被认为是制备炭材料的一种很有前途的前驱体。为了生产出具有理想性能的炭材料,必须解决由沥青复杂组成和易于软化的特性所导致的炭材料结构难以控制的问题。最近,研究人员提出了几种有效方法来调控沥青基炭材料的结构。本文总结了沥青基炭材料的结构设计、制备方法及其背后机理的最新进展,同时介绍了其在超级电容器和碱金属离子电池等储能装置中的应用。

苦荞种质资源AFLP标记遗传多样性分析

【目的】从分子水平研究苦荞种质资源的遗传多样性,为综合评价苦荞种质资源提供依据。【方法】用筛选出的20对AFLP引物,对14个不同地理来源的165份苦荞种质进行遗传多样性分析。【结果】共扩增出938条清晰的条带,其中314(33.48%)条呈多态性,平均每对引物组合的条带数和多态性带数分别为46.9个和15.7个。不同地理来源苦荞种质的Shannon-Weaver多样性指数为0.1093～0.2661,四川资源群最高,青海、云南和甘肃/宁夏等资源群次之,湖南资源群最低。利用Popgen Ver.1.32软件,依不同地理来源苦荞资源群间Nei′s遗传一致度可聚类成5个组,聚类结果与苦荞地理分布相关。基于Structure2.2软件分析,165份苦荞资源分为5大组群,并与Popgen Ver.1.32聚类结果呼应得较好,其中云南和四川资源的群体结构最复杂,最为多样化,分别被聚到了5个组群中。【结论】苦荞类群的亲缘关系以及遗传多样性与其地理分布有一定相关性。

重组PICK1蛋白的多聚形式及其与Ca^(2+)和Mg^(2+)的结合

蛋白激酶Cα相互作用蛋白1(PICK1)是从线虫到人的所有生物中非常保守的一类存在于细胞质中的膜结合蛋白,在蛋白质转运,以及细胞内信号转导过程中发挥重要作用.通过基因重组技术获得PICK1及其截短的N-PDZ(1~110残基)和BAR-C(128~416残基)重组蛋白,结合变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,以及分子排阻层析,表明溶液中的PICK1主要以二聚体形式存在.利用荧光光谱分析PICK1与金属离子Ca2+和Mg2+的结合情况.结果表明,在0.02 mol/L Hepes,pH 7.2,随着2种金属离子的不断滴加,PICK1在338 nm处的最大荧光强度逐渐降低,PICK1与Ca2+结合常数为Ka1=(2.34±0.20)×106L.mol-1,Ka2=(7.75±0.62)×105L.mol-1,而Mg2+结合常数为Ka=(5.00±0.40)×106L.mol-1.另外,对PICK1的N端区域N-PDZ和C端区域BAR-C的重组片段与金属离子Ca2+和Mg2+结合情况进一步分析表明,Ca2+既能与PICK1的N端N-PDZ结合,又可与C端BAR-C结合,而Mg2+只结合在PICK1的N-PDZ区域.比较Ca2+或Mg2+对PICK1结合脂质的影响,显示Ca2+能明显增强蛋白和脂质的结合.

苋菜红表面增强拉曼光谱的密度泛函理论研究

苋菜红(Amaranth)作为一种人工合成食品添加剂,常被添加于汽水、山楂和糖果等当中,但苋菜红是由煤焦油中分离出来的苯胺染料为原料制成,过量食用会导致基因突变甚至致癌,严重危害身体健康。因此,对其检测至关重要。表面增强拉曼光谱技术具有样品前处理简单、分析速度快和准确性高等优点,已在化学、生物和医学领域越来越显示出巨大的潜能。目前,用拉曼光谱技术对苋菜红检测的理论与实验研究还未见报道。而对拉曼光谱及表面增强理论机理的研究可以为在食品中检测及鉴定苋菜红提供可靠的科学依据。所以利用密度泛函理论全面探究苋菜红的表面增强拉曼机理并与实验结果进行对比,对食品中的苋菜红检测研究有很好的预测及指导意义。一方面,利用共聚焦显微拉曼光谱仪对苋菜红粉末进行拉曼光谱检测,得到其拉曼光谱;另一方面,搭建苋菜红分子结构,并基于密度泛函理论对分子结构进行优化处理,从前线轨道、静电势、极化率及自然键轨道布局分析四个角度进行计算分析,得出偶氮基团处(-N15=N16-)是苋菜红分子与Ag原子配位的最佳位置。在此基础上,使用B3LYP/6-31++G(d,p)基组(C,H,O,N,S,Na)和B3LYP/Sdd基组(Ag)对苋菜红分子与1个Ag原子及3个Ag原子团簇的复合物(Amaranth-Ag1,Amaranth-Ag3)进行结构优化和表面增强拉曼光谱计算。将苋菜红分子的实验与理论拉曼光谱进行比较,发现二者吻合较好,且在1228,1329,1467和1529 cm-1处苋菜红分子的拉曼活性很明显。另外,苋菜红与Ag的复合物有明显的拉曼增强效应,增强效果随着Ag原子个数的增多而愈加明显,不仅拉曼光谱的峰值个数有增多,而且其对应光谱峰位强度也有增强。进一步通过振动模式的归属,得到鉴定和识别苋菜红的拉曼特征峰。该研究为利用表面增强拉曼光谱技术检测食品中的苋菜红提供了一定的实验参考和理论依据。

高活性Co^2＋-替代海因酶中Co^2＋的定量及酶学活性鉴定

利用产D-海因酶(HDT)的重组pE-hdt/E.coli菌株,在LB培养基中添加40μmol/L的Co2+,37℃培养10h,表达产物经Q-Sepharose阴离子交换剂和Phenyl-Sepharose疏水层析,获得电泳纯Co2+-D-海因酶(Co2+-HDT).该酶对底物DL-海因的比活性较HDT高约6倍,达21.8U/mg.可见光光谱分析表明,在498nm和568nm处呈现Co2+-海因酶络合物的特征性吸收峰.用ICP-AES测定纯酶金属离子含量,HDT每摩尔亚基含0.93摩尔Zn2+和0.04摩尔Co2+,而Co2+-HDT中每摩尔亚基中含0.17摩尔Zn2+和0.89摩尔Co2+.这一结果表明,HDT中的Zn2+已被Co2+所替代.此外,在动力学常数,pH和温度稳定性,金属螯合剂EDTA的影响等方面,HDT和Co2+-HDT也略有差异.

苦荞菜中总黄酮的测定

目的测定苦荞菜中总黄酮的含量。方法可见分光光度法。结果在420 nm波长处测得即食型苦荞菜中的总黄酮含量为6．87%;苦荞芽苗在生长1,3,5,7 d的总黄酮含量分别为3．31%,4．19%,4．20%,4．15%。结论苦荞菜中富含黄酮,具有广阔的开发前景。测定方法操作简单、快速,适合中、小型食品加工企业应用。

抗菌药物治疗疾病的新靶位--丙氨酸消旋酶

丙氨酸消旋酶是以磷酸吡哆醛为辅酶,催化L-丙氨酸与D-丙氨酸相互转化的一种酶,它广泛分布在低等生物,而不存在于人类等高等真核生物中.来自不同物种的丙氨酸消旋酶一级结构同源性较高,其大多功能单位为同源二聚体,拥有2个相同的活性中心,每个活性中心均是由来自不同亚基的2个保守残基共同组成.丙氨酸消旋酶催化生成的产物D-丙氨酸是合成细菌细胞壁肽聚糖的重要成分,也是调节细菌孢子萌芽的关键因子.因而丙氨酸消旋酶与由细菌引起的肺结核、炭疽热、中耳炎等疾病密切相关.近年来丙氨酸消旋酶已成为设计抗菌药物的又一理想靶位.本文从丙氨酸消旋酶的结构、功能、作用机理、抑制剂以及其与疾病的关系等方面进行了阐述.

Periaxin蛋白与腓骨肌萎缩症

Periaxin是施旺氏细胞(Schwann cells)与晶状体纤维细胞中特异表达的支架蛋白之一.在施旺氏细胞包裹轴突形成髓鞘过程中,periaxin蛋白参与髓鞘的延展、修复及再生等.PRX基因的缺失或突变将引起脱髓鞘型腓骨肌萎缩症(CMT)4F亚型的发生.本文就periaxin蛋白分子结构特点、生理学功能、以及其基因突变与脱髓鞘型腓骨肌萎缩症CMT4F亚型的发生等进行综述.

环酰亚胺水解酶C末端区为该酶活性所必需

为了研究一个新环酰亚胺水解酶（CIH）C端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端2个Lvs替代为2个Glu或2个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE—cih293为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段．经克隆、表达与纯化，得到不同的突变酶蛋白．酶活性测定、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化；当CIH的C末端2个Lys替代为2个Glu时，酶活性及分子结构变化均不明显，但当替代为2个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态．pH及热稳定性实验也表明。酶的稳定性与其分子的完整性密切相关．结果证实，CIH的C末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用．

高效液相色谱法测定琥珀酰亚胺及其酶解产物

采用HPLC法,以Symmetry(C18柱(4·6mm×150mm,5μm),甲醇∶10mmol/L磷酸缓冲液(pH6·5)=5∶95(V/V)为流动相,在波长210nm检测条件下,使琥珀酰亚胺及其酶解产物琥珀酰胺酸得到了较好的分离。琥珀酰亚胺与琥珀酰胺酸的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数均在0·999以上。该方法既可用于定量分析琥珀酰亚胺和琥珀酰胺酸,又能用于测定环二酰胺酶的活性及产物转化率。检测精度可达μg水平;用NMR确认了酶分解物质的分子结构。

基于密度泛函理论的盐酸罂粟碱太赫兹振动光谱计算与分析（英文）

为了进一步探究太赫兹振动光谱的理论机理,为违禁药品的太赫兹光谱检测提供完善合理的科学依据,本文以盐酸罂粟碱为例,基于第一性原理的密度泛函理论计算方法,利用BLYP、LC-BLYP、B97-XD、B3LYP和CAM-B3LYP函数并结合6-311++G(d,p)基组,分别讨论其分子构象并对盐酸罂粟碱的光谱吸收特性和振动模式进行了表征和分析.计算结果表明,盐酸罂粟碱是以异喹啉N原子上的质子化阳离子和两个最低质子化构象的形式存在的.四个指纹峰中有三个是由能量最低的分子构象共振引起,另一个是由第二个最低能量的分子构象共振引起的.在该方法中,LC-BLYP函数被证明是五个函数中最合适的一个.研究表明,太赫兹时域光谱技术可以有效地检测非法药物,采用密度泛函理论合理计算振动频率,可以为今后违禁药品及各种衍生物的检验提供依据.

PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节

蛋白激酶C相互作用蛋白1(protein interacting with Ckinase1,PICK1)是调节AMPA(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体在细胞膜上的数量与分布,引起LTP与LTD现象的重要蛋白.本文利用基因克隆、荧光光谱以及免疫分析等方法,分析了PICK1蛋白C末端酸性区对BAR结构域与膜脂结合能力以及PICK1分子内BAR(Bin/amphiphysin/RVS)结构域与PDZ结构域相互作用的影响,研究了钙离子结合C末端酸性区后对上述相互作用的调节.结果显示,C末端酸性区的存在使BAR结构域与膜脂的结合能力减弱大约10倍,但PICK1分子内的BAR与PDZ结构域的相互作用与不含C末端的酸性区相比增强了大约4倍.另一方面,C末端酸性区的存在,伴随钙离子浓度的提高,有助于增强BAR与膜脂的结合,却削弱了PDZ和BAR结构域的作用.当钙离子浓度增加到500μmol/L时,BARC的脂质结合能力以及和PDZ的亲和力与不含酸性区相当.

Periaxin与腓骨肌萎缩症4F亚型

Periaxin是施万细胞特异表达的一种蛋白,在维持髓鞘稳定性方面起重要作用,该基因突变将导致脱髓鞘型常染色体隐性遗传的腓骨肌萎缩症4F亚型发生。从分子遗传学角度探讨腓骨肌萎缩症4F亚型发病的机制已成为目前研究的热点。从periaxin的分布、结构与功能开展研究,寻找与其相互作用的蛋白质并揭示其互作的生物学意义,从蛋白质水平上研究腓骨肌萎缩症的发病机制具有重要意义。

病程相关基因启动子片段与GUS的融合基因在拟南芥中的表达

PRI是拟南芥(Arabidopsis thaliana L．)系统获得抗性的一个标志基因。利用PCR技术，从拟南芥中扩增并克隆了PRJ基因的启动子片段。将该启动子片段与GUS报告基因拼接，构建成含有PRJ-GUS融合基因的重组表达质粒。经根癌农杆菌介导转化，得到了转基因的拟南芥植株。用已知的系统获得抗性激活剂处理转基因植物，检测到GUS活性。因此，这一转基因体系可以作为一种简便、灵敏的实验体系以筛选激活植物系统获得抗性的化合物。