树突状细胞疫苗治疗肿瘤的实验研究进展

树突状细胞(Dendriticcell,DC)是重要的抗原递呈细胞,在抗肿瘤免疫治疗中有巨大的应用前景,本文对近年来DC疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用研究进展作一综述,对目前研究中存在的问题作了客观的分析。

不同剂量伯氏疟原虫感染小鼠的实验观察

为了探讨小鼠腹腔接种感染P.b的剂量对感染小鼠的存活时间的影响,将小鼠腹腔接种感染P.b的剂量分为1×104个/只组、1×105个/只组、1×106个/只组3组,每组腹腔注射前经过血涂片计数发病鼠血虫率、计算各组既定剂量对应红细胞数、血细胞计数板计数接种血液红细胞数、接种感染、记录各小鼠的存活时间及血虫率。结果表明:1×104个/只组的存活时间明显延长,P.b感染小鼠存活期间,随感染剂量增多,P.b感染发展速度越快。在P.b动物实验中,尽管剂量的控制存在人为影响较大因素,但不同数量级剂量接种后仍能对实验进展起关键作用。

青藤碱对红斑狼疮患者外周血T细胞的抑制作用及机制探讨

目的:观察青藤碱(SIN)对系统性红斑狼疮患者T细胞功能的影响,探讨其免疫抑制作用机理。方法:分离SLE患者的PBMCs,加入anti-CD3及不同浓度SIN,以ELISA和流式细胞仪方法分析青藤碱对T淋巴细胞活化和Th1/Th2细胞因子产生的影响。结果:SIN可抑制SLE患者外周血T细胞产生IFN-γ、IL-2和IL-4。SIN能够显著降低CD4+T和CD8+T细胞表面活化分子CD69和CD25的表达。结论:SIN可通过抑制T细胞的活化及细胞因子的分泌,发挥免疫抑制作用。

广东省江门市华支睾吸虫病流行现状的调查与分析

目的 对江门市华支睾吸虫病流行情况进行流行病学调查和分析。 方法 2011年5~12月，从江门市7个市（区）的东、南、西、北和中部各随机抽取一个镇，每个镇随机抽取4~5个村，每村随机抽取10%家庭中3岁以上人员为调查对象，共发放14 000个粪盒，收回12 661个。采用改良加藤厚涂片法检查华支睾吸虫卵，一粪三检，阳性样品计算每克粪便虫卵数（EPG）。 结果 本次共调查了江门市7个市（区）的35个镇140个村12 661人。江门市华支睾吸虫感染率平均为10.39%（1 316/12 661），平均EPG为98.3。7个市（区）中以蓬江区感染率最高，为26.68%（402/1 507），台山市感染率最低，为0.93%（19/2 049）；鹤山市的平均感染度最高，平均EPG为225.4，台山市的平均感染度最低，平均EPG为5.13。各镇的感染率与到主要河流的距离呈负相关（r=-0.61，P〈0.01）。男性和女性的感染率分别为13.54%（822/6 073）和7.50%（494/6 588），平均EPG分别为118.9和72.5。20岁以上人群，男女的感染率和感染度均明显上升，感染率最高的年龄组为60~69岁，为14.29%（169/1 183），感染度最高的为70岁以上年龄组，平均EPG为153.8。调查发现，99.91%（12 650/12 661）的感染者为轻度感染，仅0.09%（11/12 661）的感染者为中度感染，无重度感染者。 结论 江门市7个市（区）均不同程度存在华支睾吸虫病流行，各地区感染率和感染度间差异较大，感染率高的镇主要沿大的河流分布。

婴儿眼内感染结膜吸吮线虫1例

1病例 患儿．男，3月龄，深圳人。2008年9月8日因眼部分泌物增多、畏光、红肿，沐浴时父母发现其左眼角有乳白色虫体．先后到深圳市南山区人民医院和广州市儿童医院眼科就诊．分别从其左眼内取出虫体4条和2条，但均未对虫体进行鉴定。其后，患儿父母携患儿和1条虫体到本教研室进行确诊。经检查，患儿双眼无异常体征。

华支睾吸虫感染与胆管癌发生发展关系的研究进展

目前我国有1 249多万人感染华支睾吸虫(Clonorchis sinensis),国内胆管癌的发病率亦不断增长。100多年前就有研究者提出华支睾吸虫感染与胆管癌的发生有关,并致力于其发生机制的研究,但其具体机制至今尚未明确,因此,研究两者之间的关系具有重要意义。本文从虫体机械损伤、分泌代谢产物的刺激以及机体免疫反应异常、分子和基因突变等方面对华支睾吸虫感染与胆管癌发生发展关系及其可能机制进行综述。

紫外线照射前后日本血吸虫尾蚴可溶性虫体蛋白组分的比较

目的利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫正常尾蚴及紫外线致弱尾蚴虫体间差异表达蛋白。方法分别收集与制备血吸虫正常尾蚴和致弱尾蚴虫体总蛋白,经固相pH梯度双向凝胶电泳分离。凝胶银染并利用ImageMaster2DSoftware5.0凝胶图像分析软件进行比较分析,选取差异表达蛋白点经基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪进行鉴定。结果二维凝胶电泳图像分析结果显示:正常尾蚴和致弱尾蚴各分离出至少1277、1173个清晰、独立的蛋白点,蛋白点匹配率为72.7%,大多数蛋白点相对分子量处于22000～95000范围内,理论等电点为5～8。尾蚴经紫外线致弱前后共发现18个差异表达蛋白,其中5个蛋白于致弱尾蚴中表达消失,12个表达下调,1个表达增强,未见新增表达蛋白。其中13个差异表达蛋白经MALDI-TOF-MS鉴定分析,获悉其肽指纹图谱、理论等电点、分子量及表达水平变化等相关信息。结论利用二维电泳、MALDI-TOF-MS等蛋白质组学技术,共鉴定出13个致弱尾蚴差异表达蛋白,为进一步阐明致弱尾蚴诱导宿主产生高免疫保护力的分子机制提供了实验基础。

肺炎链球菌感染的流行病学及毒力因子研究进展

肺炎链球菌感染在不同人群中的分布受各种因素影响,其流行以及菌株血清型的分布也都有明显的差异性。造成肺炎链球菌致病的各种毒力因子在致病过程中尽管作用不同,但都参与了该过程。深入了解近年来肺炎链球菌感染的流行情况及肺炎链球菌相关毒力因子的研究进展,对预防和治疗肺炎链球菌感染,研制新一代疫苗有着实际意义。

海南红树林淡紫拟青霉胞外多糖抗HSV-1作用研究

目的探讨红树林淡紫拟青霉胞外多糖体内抗单纯疱疹病毒-1(HSV-1)作用。方法选取昆明种小鼠75只,随机分为正常对照组,病毒对照组,低、中、高剂量组,每组15只。正常对照组给予DMEM 0.5 ml腹腔注射,其余4组给予HSV-10.5 ml腹腔注射。次日低、中、高剂量组小鼠分别经腹腔注射淡紫拟青霉胞外多糖6、8、10 g/(kg·d);正常对照组和病毒对照组腹腔注射生理盐水0.5 ml,连续注射7 d。观察并比较各组小鼠肝脏病理变化;5组小鼠脑组织匀浆上清液接种于Vero细胞,观察其细胞病变情况;提取同一部位脑组织病毒基因组DNA,检测病毒DNA相对含量及血清干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果与正常对照组比较,病毒对照组和低剂量组小鼠肝脏汇管区大量炎性细胞浸润,部分肝细胞肿胀;中剂量和高剂量组炎性细胞浸润明显减少。与病毒对照组相比,中、高剂量组脑组织HSV-1病毒DNA相对含量减低(P<0.01),低剂量组病毒DNA相对含量与病毒对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,其余4组小鼠血清IFN-γ、IL-12、TNF-α水平均显著升高(P<0.01);高剂量组IFN-γ水平高于病毒对照组和低、中剂量组(P<0.01);中、高剂量组IL-12水平高于病毒对照组和低剂量组(P<0.01)。与病毒对照组比较,低、中、高剂量组TNF-α水平均显著降低,且中、高剂量组低于低剂量组(P<0.01)。结论红树林淡紫拟青霉胞外多糖具有一定抗HSV-1作用,可能是通过抑制病毒复制、刺激IFN-γ和IL-12分泌,抑制TNF-α产生完成的。

日本血吸虫特异性膜蛋白的筛选及其中sj15蛋白编码序列的克隆

目的:筛选日本血吸虫可能的特异性膜蛋白,并根据筛选结果在日本血吸虫成虫中尝试克隆某一可能具有免疫保护功能的预测蛋白的编码序列,为血吸虫病防治研究寻找新的疫苗候选分子或药物靶标。方法:以"Schistosoma japonicum"和"membrane or tegument"为关键词,在公共数据库NCBI进行查找并下载数据,建立本地化的日本血吸虫膜蛋白序列数据库,与本实验室建立的曼氏血吸虫、人类、大鼠及小鼠蛋白质数据库等进行多序列比对,筛选日本血吸虫特异性膜蛋白,同时通过CBS网站相应分析工具软件预测目的蛋白的特征和功能。针对其中可能有免疫保护功能的预测蛋白的预测编码序列设计引物,采用RT-PCR技术从日本血吸虫成虫中扩增出该编码序列,并克隆入pGEX-4T-1构建原核表达重组质粒。结果:共检索到153个理论推测的日本血吸虫膜蛋白序列,筛选出28个可能的日本血吸虫特异性膜蛋白;成功从日本血吸虫成虫中扩增出相对分子质量为15 000的预测蛋白的预测编码序列,暂命名为sj15基因,同时成功构建pGEX-4T-1-sj15重组质粒。结论:成功筛选出多个日本血吸虫特异性膜蛋白;从日本血吸虫成虫中成功克隆出GenBank公布的预测的sj15基因,证实了成虫中该预测基因的存在,并成功构建原核表达载体,为进一步的功能研究奠定了基础。

广州管圆线虫致病机制的研究进展

广州管圆线虫是一种人兽共患寄生虫，幼虫侵入人体后可移至大脑，主要引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜脑炎。其发病为幼虫移行，幼虫在颅部占位并释放代谢产物，基质金属蛋白酶与纤溶酶原活化因子的产生，嗜酸性粒细胞对神经细胞的毒害及超敏反应等多因素作用的结果。偶尔该虫也可侵犯眼球，眼球病变主要是免疫反应导致的损害。了解广州管圆线虫的发病机制，对该病的防治和诊断具有重要意义。

基质金属蛋白酶在寄生虫致脑部感染中的免疫病理作用

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是内源性多肽酶类,参与机体的许多正常生理机能,如胚胎发育、创伤愈合、新生血管形成和软骨吸收等。但在感染过程中,过度表达活化的MMP常可导致免疫病理现象,引发疾病或死亡,而有利于病原体的播散或生存。疟原虫、刚地弓形虫、链状带绦虫囊尾蚴和广州管圆线虫幼虫等人体寄生虫可侵入宿主中枢神经系统,引发嗜酸粒细胞浸润为主的炎性反应。本文综述了有关寄生虫导致脑部感染时MMP的作用及其病理机制。

药物作用下的广州管圆线虫幼虫表皮纹理变化的数字化特征研究

【目的】通过采集药物作用下广州管圆线虫3/4期幼虫表面纹理变化的超微结构图像,进行数据化特征的研究,探讨可能的药物作用规律。【方法】本文采用基于灰度共生矩阵的图像纹理分析方法,对体内用药、体外用药和不用药3组共21条的广州管园线虫幼虫表皮电镜图像进行预处理后,分别在不同的扫描方向下提取对比度、能量、相关性、同质性和熵5个特征值,并进行单因素方差分析、秩和检验以及描述性统计分析。【结果】样本图像在4个方向上的几乎所有特征都有统计学意义,其中能量和熵在各方向上均具有显著性差异,对比度和同质性特征值在不同方向角度上存在差异,并呈现一定的分布规律。【结论】虫体纹理的数字特征可用于识别和评估广州管圆线虫的用药状态。

恶性疟原虫信号肽肽酶-绿色荧光蛋白突变株的建立及其在疟原虫体内的表达分析

目的构建恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)信号肽肽酶(PfSPP)基因转染载体,筛选可在体内表达疟原虫信号肽肽酶-绿色荧光蛋白(PfSPP-GFP)的疟原虫。方法提取Trager-Jensen法培养的恶性疟原虫3D7株基因组DNA,PCR扩增PfSPP C端不含终止密码子的883 bp基因片段,克隆构建重组转染载体pSPPcGT。重组载体经PCR和双酶切鉴定后送测序。电转化法将重组载体转染入恶性疟原虫体内,采用5 nmol/L恶性疟原虫二氢叶酸还原酶抑制剂WR99210筛选转染后,恶性疟原虫经无水乙醇固定、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后,荧光显微镜下观察PfSPP-GFP在其体内的表达分布情况。提取筛选后恶性疟原虫全蛋白,Western blotting分析虫体内PfSPP-GFP蛋白的表达情况。结果 PCR扩增获得PfSPP基因C端不含终止密码子的DNA片段,大小为883 bp。构建的重组转染载体pSPPcGT经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定均正确。荧光显微镜观察结果显示,筛选后恶性疟原虫细胞内有绿色荧光蛋白表达,主要位于细胞质中,表明PfSPP-GFP已成功转染至恶性疟原虫并表达。Western blotting分析结果显示,转染的恶性疟原虫可表达含PfSPP-GFP融合蛋白,与预期相对分子质量(Mr)64 000大小一致。结论构建了恶性疟原虫PfSPP-GFP重组转染载体,筛选获得了能在疟原虫体内表达PfSPP-GFP的突变株。

秀丽隐杆线虫C31B8.8基因的克隆、表达及免疫特性分析

目的克隆、表达野生型秀丽隐杆线虫C31B8.8基因,并分析其免疫特性。方法提取人工培养的秀丽隐杆线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增C31B8.8基因,克隆入pMD-18T载体,测序正确后将C31B8.8基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白C31B8.8。用钴离子柱亲和层析法纯化该蛋白。融合蛋白采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定和蛋白质印迹(Western blotting)分析。10只BALB/c小鼠随机均分为抗原免疫组和佐剂对照组,抗原免疫组以纯化的重组C31B8.8蛋白免疫小鼠,抗原免疫剂量为40μg/(只·次),共免疫4次,每周免疫1次。佐剂对照组以PBS代替抗原,同法免疫小鼠。每次免疫前取血,末次免疫后1周眼球采血,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。同时以C31B8.8蛋白和广州管圆线虫Ⅳ期幼虫虫体可溶性蛋白作为抗原进行Western blotting。结果 DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组C31B8.8蛋白。重组蛋白经质谱鉴定和Western blotting分析证实为目的蛋白。纯化C31B8.8蛋白免疫小鼠后,与对照组相比,能产生较高的抗体水平。Western blotting分析显示,重组C31B8.8蛋白能被免疫血清识别,且免疫血清与广州管圆线虫Ⅳ期幼虫虫体可溶性抗原存在交叉反应。结论秀丽隐杆线虫C31B8.8蛋白具有较好的免疫原性和免疫反应性,重组C31B8.8蛋白免疫小鼠血清与广州管圆线虫Ⅳ期幼虫虫体可溶性抗原存在交叉反应。

光动力法制备DC胶质瘤疫苗抗肿瘤作用的研究

目的:研究光动力法(photodynamic therapy,PDT)处理后,用酸洗法获取C6胶质瘤细胞的抗原肽,制备树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗,诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)在体外杀伤C6细胞的活性,以及PDT对C6胶质瘤细胞免疫原性的直接影响。方法:自大鼠骨髓分离DC前体细胞于体外诱导、扩增获得成熟DC。C6细胞经PDT处理后,对尚贴壁的细胞以酸洗法获取其表面抗原,从上清液中提取全细胞抗原,未作PDT处理的C6细胞以酸洗或冻融法提取抗原。分别以这4种抗原致敏DC,制成DC疫苗接种SD大鼠后,取脾作CTL的体外杀伤活性测定。结果:用PDT处理后酸洗法获得的抗原刺激DC成熟的能力最强,它制备的DC疫苗诱导的CTL的体外杀伤率最高,为(95.5±1.6)%,而光照后上清组为(90.2±2.4)%,酸洗组为(73.3±2.7)%,冻融组为(63.6±4.9)%,PBS对照组为0。结论:PDT能直接增强肿瘤细胞的免疫原性,用酸洗法获取PDT处理后的肿瘤细胞的抗原肽制备DC疫苗是一种有前景的新方法。

抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定

目的激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白。结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。

核酸负载纳米金的改良ELISA高灵敏检测平台的构建

目的构建基于核酸负载纳米金(AuNPs)的酶联免疫吸附试验(ELISA)高灵敏检测平台。方法将生物素化DNA通过金-硫键结合在AuNPs上,制备纳米金生物素化DNA(AuNPs@DNA-B)信号探针,在ELISA检测目标分子的基础上,使信号探针通过链霉亲和素结合于夹心复合物中的生物素化抗体上,发挥信号放大作用,实现对目标分子的高灵敏检测。该研究选用血清水平极低的抗体免疫球蛋白(Ig)E作为目标分子,验证该检测平台的可行性。结果通过紫外光谱扫描、透射电镜观察,发现制备的AuNPs颗粒大小均匀、分散性好。在最优条件下,该方法对选定的目标分子IgE的最低检测限为0.012 ng/mL;批内变异系数<2.0%,批间变异系数<6.1%;该方法的回收率为(99.956±0.168)%~(104.733±3.376)%,传统ELISA为(99.100±0.529)%~(100.044±0.276)%,差异无统计学意义(P>0.05)。其检测灵敏度与化学发光法相近。结论该研究成功构建了基于AuNPs@DNA-B的信号放大ELISA高灵敏检测平台。