黄鳝生殖发育不同时期性腺差异蛋白的初步研究

提取黄鳝从雌性性逆转发育为雄性过程中7个不同生殖发育时期生殖腺的总蛋白,通过考马斯亮蓝染色扫描分析,选出在相对分子质量17附近的一条蛋白带进行基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱分析(MAL-DI-TOF),搜库显示与其匹配的蛋白为二磷酸核苷激酶(Nucleoside diphoshate kinase,NDPK).该蛋白带的表达由雌性发育→雄性发育呈现逐渐减弱的趋势,在黄鳝的性腺发育中,NDPK可能参与了黄鳝生殖腺的性逆转过程.

NTERA-2的精原干细胞生物学特征鉴定

本研究通过免疫荧光分析,鉴定NTERA-2细胞是否具有精原干细胞特征。研究结果显示,重要精原干细胞标记分子GFRα-1和DDX4在NTERA-2细胞中均表现为阳性表达,NTERA-2细胞具有精原干细胞的特征。初步探讨了重要细胞信号转换蛋白JNK特异性抑制剂SP600125对NTERA-2细胞生长和增殖的影响,为进一步以NTERA-2细胞为精原干细胞模型开展JNK对生殖细胞发育调节功能的研究奠定基础。

ERK/JNK在黄鳝雌、雄发育阶段生殖腺中的表达和定位

为探讨MAPK家族中ERK和JNK两个主要亚族在黄鳝雌、雄发育阶段生殖腺中的表达状况,应用蛋白质免疫印迹杂交技术和免疫组织化学法检测了ERK、JNK在黄鳝卵巢组织和精巢组织中的表达和定位。蛋白免疫印迹杂交显示:ERK在黄鳝雌、雄性腺组织中均有强的表达;JNK在性腺中的表达总体上弱于ERK,JNK1在精巢组织中的表达比卵巢组织显著降低,但JNK2在雌、雄性腺组织中的表达无明显差异。在免疫组织化学的观察中,ERK和JNK在卵原细胞和精原细胞中均为阳性反应,且定位相似:细胞质及细胞核核质呈阳性反应,核仁阴性。随着卵母细胞生长和成熟,ERK和JNK在卵母细胞胞质中阳性反应逐渐减弱。实验结果提示,ERK和JNK在黄鳝卵巢发育。

jnk3基因在金鱼和斑马鱼不同发育时期胚胎与成体不同组织中的分化表达

JNKs是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员,参与应激反应和动物体轴的构建。为了进一步了解JNK家族在动物发育中的功能,首次分离和克隆了金鱼jnk3基因,研究了jnk3在金鱼和斑马鱼组织特异性和胚胎发育特异性表达状况。金鱼jnk3基因cDNA总长1 794 bp,其中阅读框1 293 bp,编码430个氨基酸。对jnk3基因序列及其推导的氨基酸序列进行同源性分析,结果显示,jnk3基因在脊椎动物较为保守,金鱼jnk3基因核苷酸序列与斑马鱼、人的同源性分别为94.1%和80.7%,金鱼jnk3基因氨基酸序列与斑马鱼、人的同源性分别为99.7%和93.4%。jnk3基因在鱼类成体中的表达存在着显著的组织差异,在金鱼和斑马鱼脑和精巢组织的表达具专一性,此外在斑马鱼心脏中也检测到jnk3的表达。RT-PCR检测结果显示,在鱼类胚胎发育中,神经胚期开始检测到jnk3基因mRNA表达,从神经胚到心跳期胚胎,jnk3基因表达水平逐渐增高,此后直至出膜一直保持较高的表达水平。研究表明,jnk3基因可能在鱼类后期的胚胎发育和成体脑、精巢与心脏发育中具有重要作用。

三倍体鲫鱼早期胚胎发育观察

以异源四倍体鲫鲤为父本，二倍体金鱼为母本通过倍间杂交形成三倍体鲫鱼．对三倍体鲫鱼早期胚胎发育过程进行了观察．三倍体鲫鱼成熟卵子呈黄色，圆形，有粘性，卵径为1．3—1．4mm．水温为（20±1）℃情况下，卵子受精后1h，卵裂开始．受精后在-3h时间段内进行卵裂．受精后3．50h逐渐进入早、中、晚囊胚期，受精后10h进入原肠期，受精后15．50h进入神经胚期，19．0h后器官开始形成．受精后63—75h，仔鱼孵化出膜．另外，对三倍体鲫鱼受精卵进行切片观察，结果表明：三倍体囊胚期细胞分裂旺盛，原肠期细胞表现出正常的细胞分裂、细胞变形和迁移行为．结合三倍体鲫鱼胚胎外观发育观察，说明三倍体鱼具有正常的早期胚胎发育过程，为三倍体鱼的大规模生产提供了胚胎发育的生物学依据．

黄鳝生殖干细胞在性逆转生殖发育过程中的变化

应用组织学方法及免疫组织化学技术显示,黄鳝性逆转生殖发育过程中,生殖干细胞(GSCs)定位分布于生殖褶中,黄鳝雌性发育阶段的GSCs分散或成团存在,间性及雄性发育阶段GSCs均区分为A、B两种不同类型,雌性发育阶段GSCs与A、B两类GSCs在超微结构上存在差异。结果表明,生殖褶中GSCs是黄鳝分化生殖腺中唯一具有有丝分裂能力的生殖细胞群,雌性发育阶段GSCs表现出卵原干细胞特征,间性及雄性发育阶段GSCs为精原干细胞。CD49整合素是黄鳝雌性发育阶段GSCs和A类GSCs的表征分子。

雌核发育鲫鲤早期胚胎发育观察

雌核发育二倍体鲫鲤第二代(G2)产生的卵子经紫外线灭活的散鳞镜鲤精子的诱导,无需染色体加倍处理,可以发育成为雌核发育鲫鲤第三代(G3).描述了G3的早期胚胎发育过程.雌核发育鲫鲤的卵为粘性卵,色素含量高,在(19±1)℃水温下,受精后70 min第一次卵裂,原肠晚期统计受精率为37.36%,约89 h后,受精卵开始脱膜,约106.5 h后,胚体完全脱膜,最终统计孵化率为26.11%.

中国大鲵(Andrias davidianus)的胚胎发育

对中国大鲵(Andrias davidianus)胚胎发育过程的外部形态及器官发育特点进行了详细地描述,为中国大鲵胚胎发育制定出完整的分期标准.中国大鲵胚胎发育过程依据形态学和组织学特征可以划分为6个阶段:卵裂阶段、囊胚阶段、原肠胚阶段、神经胚阶段、器官形成阶段、孵化阶段,共20个时期.从整体上来看,中国大鲵的胚胎发育特征与东方蝾螈(Cynops orientalis)、黑斑蛙(R.nigromaculata)大体相似,主要的差异表现在早期卵裂方式以及消化系统的发育方面.形态学及组织学观察表明,中国大鲵卵裂并非盘状卵裂类型.同时,中国大鲵胚胎发育过程中前三次卵裂均为经裂,胚胎消化系统的发生发育迟缓,无平衡器或口吸盘等,这些均为中国大鲵胚胎发育的显著特点.

两个人工雌核发育草鱼群体遗传纯合性分析

为了进一步了解和掌握2005年、2006年两个人工雌核发育草鱼群体的纯合性,以普通草鱼为对照,采用多个随机引物进行RAPD-PCR扩增,对两个人工雌核发育草鱼群体进行了遗传纯合性分析.实验结果表明:普通草鱼多态位点比例为27.28%,群体内遗传相似度系数为0.9322;2005年人工雌核发育草鱼多态位点比例为16.00%,群体内遗传相似度系数为0.9616;2006年人工雌核发育草鱼的多态位点比例为19.59%,群体内遗传相似度系数为0.9515.分析表明,两个人工雌核发育草鱼群体的遗传纯合度高于普通草鱼,2006年人工雌核发育草鱼群体的遗传纯合性较2005年低.

色素细胞谱系及其发育调控研究进展

色素干细胞是一种来源于神经嵴并能够分化产生色素细胞的干细胞.了解色素细胞谱系分化和发育的生物学规律,掌握体色形成的分子调控机制,可为临床治疗以及观赏动物的人工培育提供理论基础.概述了动物色素细胞谱系来源和组成,色素干细胞分化发育的分子调控研究进展.

α-L-岩藻糖苷酶基因在斑马鱼发育过程中的功能分析

α-L-岩藻糖苷酶(alpha-L-fucosidase,FUCA1/2)是糖基水解酶家族的成员,参与糖蛋白、糖脂等生物大分子的分解代谢反应.为了解α-L-岩藻糖苷酶在动物发育中的功能,检测了fuca1和fuca2在斑马鱼组织和胚胎发育中的特异表达模式.fuca1和fuca2基因在斑马鱼成体中的表达存在组织差异,在斑马鱼的精巢中表达量最高,此外肝脏中也检测到fuca1和fuca2的高表达.在斑马鱼胚胎发育中,在其整个胚胎发育时期均检测到了fuca1和fuca2的表达.构建了fuca1基因的反义表达载体,显微注射到斑马鱼受精卵.统计结果显示反义载体注射导致斑马鱼胚胎高致死率.研究表明,fuca1和fuca2基因在鱼类胚胎发育和成体的精巢、卵巢与肝脏发育中可能具有重要的作用.

四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫染色体减数分裂观察(英文)

用精巢细胞直接制片法观察了异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫、湘江野鲤精母细胞染色体第一次减数分裂中期配对情况 ;作为对照 ,观察了上述四种鱼肾细胞的有丝分裂中期染色体。在精母细胞第一次减数分裂中 ,异源四倍体鲫鲤同源染色体两两配对 ,形成 10 0个二价体 ,没有观察到单价体、三价体和四价体 ;三倍体湘云鲫精母细胞形成 5 0个二价体和 5 0个单价体 ;红鲫和湘江野鲤精母细胞分别形成 5 0个二价体。肾细胞检测表明异源四倍体的染色体数目为 4n =2 0 0 ;湘云鲫为 3n =15 0 ;红鲫和湘江野鲤分别为 2n =10 0。减数分裂时染色体分布情况与肾细胞染色体检测结果相吻合。具有四套染色体的异源四倍体鲫鲤在减数分裂中只形成 10 0个二价体 ,而不形成 2 5个四价体或其它形式 ,为产生稳定一致的二倍体配子提供了重要的遗传保障 ,也为人工培育的异源四倍体鲫鲤群体能够世世代代自身繁衍下去提供了重要的遗传学证据。三倍体湘云鲫在减数分裂过程中出现二价体、单价体共存 ,同源染色体在配对和分离中出现紊乱 ,导致非整倍体生殖细胞的产生 。

远缘杂交形成的二倍体鱼和多倍体鱼生殖细胞染色体研究

本文采用性腺染色体制片及组织学切片方法,系统地研究了不同发育时期的鲫鲤杂交第二代(F2)(2n=100)、异源四倍体鲫鲤(4n=200)、三倍体鲫鱼(3n=150))、雌核发育二倍体鲫鲤第二代(G2)(2n=100)及鲤鱼(CyprinuscarpioL)(2n=100)(对照组)生殖细胞的染色体特征。研究结果表明,对照组中鲤鱼精原细胞染色体数与体细胞染色体数一致,为二倍体精原细胞(2n=100),而远缘杂交形成的二倍体鱼和多倍体鱼的生殖细胞中则观察到明显的染色体数加倍现象,其中,鲫鲤杂交第二代(F2)精巢生殖细胞染色体数加倍现象特别丰富,占检测的染色体分裂相的21.6%,为其产生不减半的二倍体配子提供了直接的细胞学证据,同时也说明远缘杂交是导致生殖细胞染色体数加倍的一个重要因素。该研究在探讨多倍体鱼的发生及鱼类遗传育种方面具有重要意义。

异源四倍体鲫鲤Sox9a基因保守区序列的克隆及内含子剪接位点分析

用特异于HMG box保守区的兼并引物扩增了异源四倍体鲫鲤及其原始亲本 (红鲫和鲤鱼 )的Sox基因 .异源四倍体鲫鲤的扩增产物共有 4条带 ,大小分别约为 2 0 0 ,6 0 0 ,90 0和1 90 0bp,而其原始亲本的扩增产物只有 3条带 ,且在雌雄个体中未发现性别特异扩增带 .回收雄性四倍体鱼 6 0 0bp扩增带 ,经亚克隆及测序分析得到一个新的编码 71个氨基酸残基的基因 .该基因与虹鳟鱼 (Oncorhynchusmykiss)、蟾蜍 (Xenopuslaevis)、鲤鱼 (Cyprinuscarpio)等的Sox9基因相似性达 97% ,据此命名为Atsox9a .通过计算机分析和RT PCR方法确定该基因含有内含子 ,并获得其内含子的序列和剪切位点 ,此内含子剪切位点在进化上是保守的 .

整合素CD29/CD49/CD90在天然性逆转黄鳝雌雄生殖腺中的表达状况

整合素是细胞黏附分子家族中的一员,参与调节细胞的生长、增殖与分化.黄鳝是一种雌性先熟的雌雄同体鱼类,其性逆转发育机制亟待研究.应用免疫组化方法探讨CD29,CD49,CD90 3种整合素分子在黄鳝雌、雄性发育中的表达状况.研究结果表明,CD29,CD49,CD90在雌性生殖腺各级卵母细胞中均不表达,位于生殖褶边缘的性原细胞中可见表达;在雄性生殖腺的初级精原细胞中表达,但在成团分布的次级精原细胞、各级精母细胞中均未表达.

黄鳝成体性腺组织生殖干细胞的体外培养及鉴定

通过黄鳝成体性腺组织的体外培养，探讨黄鳝成体性腺生殖干细胞体外分离培养与鉴定的方法．分离黄鳝性腺组织进行植块培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况．利用H．E、油红0染色、碱性磷酸酶（AP）细胞化学染色等方法对培养细胞进行鉴定．黄鳝成体性腺组织原代培养3～5d，可见组织周围有细胞迁出，并形成生长晕．15d左右，生长晕直径可达3～3．2mm，生长晕中的细胞主要包括：成纤维细胞、神经样细胞、类生殖干细胞三种类型．成纤维细胞呈不对称的长梭形，突起短而多，细胞核较浅，核仁明显，有2～3个核仁，是生长晕的主要细胞成分．神经样细胞具有放射丝状细胞突起，油红O染色呈阳性反应．类生殖干细胞呈圆形，单核或多核，核质比大，AP染色呈现出阳性反应．探索了适于黄鳝成体性腺组织体外培养的条件和方法，并对原代培养的细胞进行了初步鉴定，为进一步利用体外培养的黄鳝成体性腺生殖干细胞开展黄鳝性逆转分子机制研究奠定了基础．

新型湘云金鳙遗传多样性的RAPD及微卫星分析

湘云金鳙是本实验室经过近十年的工作选育出来的,该种鱼通体金红色,肉质鲜嫩,生长速度快,是一种很有价值的养殖鱼种和实验材料。随机选取12尾湘云金鳙(RBC)和12尾来自湘江流域的普通鳙鱼BC(作为对照)进行RAPD和微卫星分析。在优化RAPD检测条件基础上,从230个随机引物中筛选出来的45个扩增较好且多态性强的引物对这两个群体的DNA多态性及分子标记进行了分析。结果显示在45个随机引物的扩增谱带中找到了2个引物(S20、S46)的特异扩增谱带,可以作为RBC和BC间的分子遗传标记。普通鳙鱼群体内个体之间的遗传距离范围从0.04-0.13,群体内的平均遗传距离为0.075,而湘云金鳙群体内个体之间的遗传距离范围从0.02-0.35,群体内的平均遗传距离为0.139。这表明湘云金鳙群体遗传多样性明显强于普通鳙鱼群体。从32对微卫星标记中筛选9对微卫星标记用于两个群体24个个体的扩增。平均每个微卫星位点在湘云金鳙群体和普通鳙鱼群体中检测到的平均有效等位基因数分别为2.44和1.89。普通鳙鱼群体的平均杂合度期望值(0.34)和平均杂合度观测值(0.39)要比湘云金鳙群体的平均杂合度期望值(0.51)和平均杂合度观测值(0.54)的小得多。由此可见,RAPD和微卫星这两种方法得出的结果是一致的,普通鳙鱼群体的遗传多样性比湘云金鳙群体低。此外,通过RAPD和微卫星对两种鳙鱼遗传多样性水平的分析,为鳙鱼种质保护提供科学证据,为鳙鱼良种选育提供了更多的遗传学背景资料。

黄鳝α-L-岩藻糖苷酶基因克隆及其在雌雄个体间的表达分析

FUCA1是糖基水解酶家族的成员之一,参与糖蛋白、糖脂等生物活性大分子的分解代谢反应.为了进一步了解α-L-岩藻糖苷酶在鱼类生殖发育中的功能,首次分离了黄鳝FUCA1基因,利用在线软件SMART对所克隆出来的FUCA1基因部分核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行对比分析,其结果表明该序列包含了3个跨膜结构域和4个低拷贝区域.通过RT-PCR检测了FUCA1在黄鳝性腺组织特异性表达状况,FUCA1基因在黄鳝雌性性腺中的表达量高于在雄性性腺的表达量.FUCA1基因在黄鳝雌雄个体间的差异性表达表明,FUCA1基因可能参与黄鳝性逆转生殖发育调控.

重要转录因子FoxO3a在斑马鱼性腺中的表达分析

FoxO蛋白作为Forkhead Box家族的重要一员,在动物的生长发育、细胞分化、代谢、免疫和凋亡等方面起重要作用,研究发现FoxO蛋白是哺乳动物卵泡发育的重要调节因子.通过检测雌雄斑马鱼性腺中foxo3a基因的表达情况,初步研究FoxO在鱼类生殖发育中的作用.PCR和蛋白免疫杂交结果都显示foxo3a基因在斑马鱼雌性性腺中的表达量要明显高于雄性.这一结果提示,foxo3a基因在斑马鱼的卵巢发育中可能发挥重要作用.

ERK1/2在三倍体湘云鲫组织及胚胎中的表达分析

在细胞信号网络中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传递途径起着极为重要的作用,控制着细胞多种生理过程,如细胞生长、发育、分裂、死亡等.ERK是MAPK家族重要的成员,通过检测三倍体湘云鲫胚胎和成体组织中ERK1/2的表达情况,初步研究ERK在鱼类发育中的作用.蛋白免疫杂交结果显示ERK1/2在三倍体湘云鲫的胚胎发育各个时期和组织中均有较高的表达,该结果表明ERK在鱼类发育的过程中发挥重要的作用.