定点突变法确定人体CYP2A6和CYP2A13香豆素代谢的关键氨基酸

【目的】通过比较人体主要尼古丁代谢酶CYP2A6和CYP2A13野生型及突变体酶蛋白对香豆素7-羥化反应的催化动力学特征,确定影响两者催化活性差异的关键氨基酸残基,提供建立评估人群尼古丁代谢酶基因多态性与吸烟行为及癌症易感性生物标记的依据。【方法】运用定点突变和Sf9昆虫杆状病毒蛋白表达体系产生CYP2A6和CYP2A13在300,301以及369位点氨基酸互换的突变体蛋白质,测定系列香豆素浓度下的各个酶蛋白对香豆素7-羥化的催化反应活性,获得动力学参数并与野生型酶蛋白进行比较分析。【结果】与野生型CYP2A6相比较,其Ile300→Phe突变体催化效率(Kcat=Vmax/Km)显著下降而Gly301→Ala突变体催化效率显著上升(1.64和8.02相对于野生型3.56,P<0.01)。与之相对应,CYP2A13的Phe300→Ile突变体催化效率则明显上升而Ala301→Gly突变体催化效率显著下降(1.03和0.06相对于野生型的0.27,P<0.05)。这些酶催化特性的改变,主要是由于Vmax的改变所致。369位的氨基酸残基,无论是Ser还是Gly对CYP2A6或CYP2A13的香豆素7-羥化反应催化活性均无明显的影响。【结论】300和301位的氨基酸是影响CYP2A6及CYP2A13对香豆素7-羥化反应催化活性的关键残基,而369位氨基酸不影响此活性。