通过融合白蛋白结合域延长抗CD47纳米抗体的半衰期

纳米抗体是一类在生物医药中具有重要应用前景的蛋白药物,然而由于其分子过小极易被清除.为了获得更好的体内代谢,我们通过CD47纳米抗体融合表达白蛋白结合域(ABD),从而提高其体内半衰期.使用分子克隆技术合成构建带有CD47-ABD基因的原核表达载体pET22b-3D3-2-ABD,转入BL21(DE3)中进行表达及Ni~+亲和层析柱纯化,并使用酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性.给小鼠尾静脉注射融合蛋白后在不同时间点采血,用双抗体夹心ELISA测定融合蛋白的血浆浓度,并计算药代动力学参数.获得了pET22b-3D3-2-ABD重组质粒,并在BL21(DE3)表达了CD47-ABD融合蛋白.通过Ni~+亲和柱纯化,获得了较高纯度和浓度的CD47-ABD融合蛋白;改造后的CD47-ABD融合蛋白仍保留抗原结合活性,与CD47抗原及人血清白蛋白(HSA)的结合活性均具有剂量依赖性.CD47-ABD融合蛋白的半衰期从改造前的35.82 min延长至了501.52 min.本研究证明了融合ABD能够显著延长CD47纳米抗体体内半衰期而不影响其抗原结合,为解决纳米抗体自身半衰期短的缺点提供了理论和技术参考.

抗布鲁氏杆菌Ⅳ型分泌系统表面蛋白VirB12纳米抗体的制备

目的制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体,为后续研究奠定基础。方法采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼,从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA,通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆,ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列,最后得到个5非冗余序列,分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株,在16℃下进行胞间质可溶性表达,经Ni亲和柱纯化表达后,Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×108 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明,5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%,且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性;4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性,在90℃处理后,仍能保留60%以上的结合活性。结论通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体,为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。