新牧1号苜蓿两个抗逆相关基因启动子的克隆及分析

采用实时荧光定量PCR分析了新牧1号苜蓿(Medicago varia Xinmu-1)MvNHX1和MvDREB1基因在盐胁迫下的表达情况。此外,根据已获得的MvDREB1和MvNHX1基因序列设计特异引物,并以新牧1号苜蓿的基因组DNA为模板,克隆得到了这两个基因的启动子。利用生物信息学方法,分析这两个基因启动子的类型和结构,结果表明,MvNHX1和MvDREB1基因的启动子序列中均含有通用启动元件和上游调控元件,如CAAT框、TATA框、光响应元件、低温响应元件等,但部分响应元件的种类和数量不同。通过对两个基因启动子的克隆、分析及比较为进一步研究这两个基因的表达调控机制奠定了基础。

新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

为了进一步研究新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子的功能,采用双酶切的方法,用核酸内切酶SacⅠ和NcoⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒pEASY-T1-simple-pMvNHX1,然后回收目的片段。通过T4DNA连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌DH5α,通过画板,卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PCR及双酶切鉴定该载体后,用冻融法将其导入农杆菌EHA105。结果表明,成功培养出含有抗逆相关基因MvNHX1启动子pMvNHX1∶GUS∶EHA105的菌落;成功构建出新的植物表达载体pMvNHX1∶GUS。

转MvP5CS基因棉花抗旱性及其育种价值评价

利用花粉管通道法,获得的转Δ1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxylate synthetase,MvP5CS)高代棉花材料,比较田间干旱胁迫下转MvP5CS基因的T6代3个株系植株与受体棉花材料D5主要生理生化指标和农艺性状的差异。结果表明:从生理生化指标分析,转基因棉花比非转基因棉花植株更有利于在干旱胁迫条件下生长。从干旱胁迫后测量的农艺性状、产量性状和纤维品质的比较发现,转基因棉花植株的叶片颜色更绿;植株的主根更长,须根更多,更强壮;转基因棉花在单铃重、籽棉产量、皮棉产量、棉花衣分等性状明显优于非转基因棉花;纤维长度和强度略有增加,马克隆值降低,品质得到改善。

转MvNHX1基因棉花抗旱性研究和株系变异分析

为培育转基因抗逆棉花,本研究分析了通过花粉管通道法获得的转MvNHX1基因的10个棉花株系T5代棉花在干旱胁迫后的生理指标和农艺性状,综合分析转MvNHX1基因棉的抗逆性和育种价值。研究结果表明,经干旱胁迫后,形态方面转基因植株叶片颜色比非转基因植株绿,使得转基因植株光合作用更强;转基因植株的根系更发达,吸收水的能力更强。生理指标测定后发现,转基因棉花植株的叶片叶绿素含量提高了1.71倍,脯氨酸含量提高了1.68倍,丙二醛含量降低了31.7%。主要的农艺性状方面,在干旱胁迫下,转基因棉花株系有些农艺性状和产量性状高于对照,其中转基因株系10Z098-6、10Z098-3、10Z098-4、10Z098-2、10Z093和10Z032在有效铃数、有效果枝数、单铃重、皮棉、子棉和衣分等指标上明显高于对照,这些株系可以作为后续遗传育种材料。本研究为进一步培育转基因抗逆棉花品系奠定了基础。