炭疽芽孢杆菌PA-LF1融合蛋白的原核表达及其反应原性研究

【目的】构建炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202 PA-LF 1融合基因表达载体并对其进行原核表达和反应原性检测,为炭疽亚单位疫苗制备、炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供依据。【方法】根据GenBank中登录的炭疽芽孢杆菌PA和LF基因序列设计2对引物,利用PCR方法从炭疽芽孢杆菌弱毒株C40-202中分别扩增出PA和LF 1基因片段,经XhoⅠ限制性内切酶消化后,通过黏性末端进行连接,获得PA-LF 1融合基因片段,利用SWISS-MODEL分析软件分别对PA、LF1和PA-LF1融合蛋白进行三级结构预测;将融合基因片段克隆至pET32a(+)质粒中,构建重组质粒pET32a-PA-LF1,并将重组质粒pET32a-PA-LF1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达,Western blotting鉴定融合蛋白并分析其反应原性。【结果】从炭疽芽孢杆菌弱毒C40-202株成功扩增出PA、LF 1和PA-LF 1融合基因;成功构建了炭疽芽孢杆菌PA-LF 1融合基因表达质粒pET32a-PA-LF1,融合蛋白三级结构预测可折叠为正确的空间构象;构建的重组质粒经诱导表达、纯化和SDS-PAGE,获得分子质量为96 ku的融合蛋白,以包涵体形式表达;经Western blotting验证,纯化后的重组蛋白与经Ⅱ号炭疽芽孢苗免疫后的绵羊血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。【结论】PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性,可为炭疽诊断和疫苗免疫效果检测提供理论依据,同时也可作为一种炭疽亚单位疫苗的候选组分。

LIPI-3和LIPI-4共存对致病性单核细胞增生李斯特菌毒力的影响

【目的】探究单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力岛3(LIPI-3)和LIPI-4共存对LM毒力的影响,揭示它们对细菌毒力的潜在调节作用,为进一步研究LM的致病机制提供依据。【方法】以LM928(存在LIPI-4)和LM873(同时存在LIPI-3和LIPI-4)2个LM菌株为研究对象,通过侵染HCMEC/D3细胞监测2种菌株对HCMEC/D3细胞的黏附和侵袭情况;通过鸡胚感染试验评估2株菌对鸡胚半数致死量(LD 50)的影响;采用溶血试验来测定菌株的溶血活性;通过流式细胞仪分析HCMEC/D3细胞凋亡情况,以评估菌株诱导细胞凋亡的能力;利用实时荧光定量PCR技术比较2株菌在BHI培养条件下及感染HCMEC/D3细胞后毒力基因的转录水平差异。【结果】LM928和LM873株的黏附率无显著差异(P>0.05),LM928株的侵袭率极显著高于LM873株(P<0.01)。LM873株的LD 50是LM928株的约1000倍;LM928和LM873株的溶血价分别为24和23。LM928株感染24和48 h后诱导的细胞凋亡率显著或极显著高于LM873株(P<0.05;P<0.01),而LM873株的凋亡率与对照组间无显著差异(P>0.05)。LM928和LM873株在BHI培养基中培养时,与LM928株相比,LM873株毒力基因mpl、inlB、inlC、inlP、actA、plcA、plcB和sigB的转录水平均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),毒力基因hly、inlA和iap的转录水平均极显著或显著下调(P<0.01;P<0.05)。LM928和LM873株侵染HCMEC/D3细胞后,与LM928株相比,LM873株毒力基因inlP、actA、plcA、plcB和prfA的转录水平均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);毒力基因hly、mpl、inlA、inlB、inlC和iap的转录水平均极显著下调(P<0.01)。【结论】LIPI-3和LIPI-4共存降低了LM的毒力,该结果对进一步研究LIPI-3和LIPI-4在细菌毒力调控中的分子机制和复杂的相互作用具有重要意义。

LIPI-4 EⅡA基因对单核细胞增生性李斯特菌重要毒力基因转录调控作用的研究

为探究单核细胞增生性李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)的膜透性酶ⅡA(EⅡA)基因在LM中的毒力作用,本研究利用同源重组技术构建了具有遗传稳定性的LM928菌株EⅡA基因缺失株(LM928ΔEⅡA)和回补株(CLM928ΔEⅡA),通过对缺失株、回补株和亲本株生长特性测定分析EⅡA基因对LM体外生长能力的影响。提取各菌株RNA,反转录为c DNA后通过real-time PCR检测各菌株在体外培养条件下LM重要毒力基因的转录水平,分析EⅡA基因缺失对LM毒力基因转录水平的影响。结果显示,缺失EⅡA基因后不影响细菌在体外的生长能力,但细菌plcB和inlA基因的转录水平显著下调(P<0.05),hly、prfA、plcB、inlA、inlB、inlC和mpl基因的转录水平极显著下调(P<0.01),plcA基因的转录水平极显著上调(P<0.01),而actA基因的转录水平无明显变化(P>0.05)。将LM928、LM928ΔEⅡA和CLM928ΔEⅡA菌株分别感染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后,采用CCK8法检测EⅡA基因对HCMEC/D3活性的影响,同时通过胞内增殖试验检测EⅡA基因对LM胞内增殖的影响,进一步采用real-time PCR方法检测EⅡA对细胞毒力基因转录水平的影响,结果显示,与LM928组相比,LM928ΔEⅡA组HCMEC/D3细胞活性无明显改变;LM928ΔEⅡA感染HCMEC/D3后6 h~12 h,胞内LM928ΔEⅡA载菌量极显著高于胞内LM928载菌量(P<0.01),在感染HCMEC/D3后2 h~12 h,胞内LM928ΔEⅡA载菌量也极显著高于胞内CLM928ΔEⅡA的载菌量(P<0.01)。相对于亲本株,LM928ΔEⅡA感染的细胞中毒力基因prf A、plc A、plc B、inl A、inl B、inl C和mpl转录水平均极显著上调(P<0.01),actA基因的转录水平显著上调(P<0.05),hly基因的转录水平极显著下调(P<0.01)。本研究结果首次证实LIPI-4中EⅡA基因对LM体外生长无影响,但其对体内、外LM毒力因子的转录均具有显著的调控作用,提示LM LIPI-4可能通过EⅡA参与调控细菌毒力,该结果为进一步研究LIPI-4在LM致病中的作用奠定了基础。

新疆食源性单增李斯特菌监测及血清型分析

目的了解新疆食品中单增李斯特菌的污染状况,为食源性疾病的监测提供科学依据。方法按照GB4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》,共监测分析了2013~2019年的3329份样品。结果在3329份样品中共检出59份单增李斯特菌阳性样品,检出率为1.77%;共分离得到63株单增李斯特菌,分为4个血清型(1/2a、1/2b、1/2c和4b),优势血清型为1/2a,占57.14%(36株)。食品中存在不同血清型混合污染。在即食食品中监测到4b型。结论新疆食品中存在单增李斯特菌的污染,卫生监督部门尤其要加强肉制品和即食食品的监管力度。

犊牛源肠外致病性大肠杆菌分离鉴定、致病性及耐药性分析

【目的】确定新疆喀什地区某规模化牛场致犊牛死亡的细菌性病原体及其生物学特性,为该地区规模化牛场细菌病的防治和合理用药提供参考。【方法】对死亡犊牛进行病理解剖及病原分离,挑选肝脏(KS-1)与肛拭子(KS-2)来源的单菌落纯化培养,通过形态观察、生化试验、16S rRNA基因扩增及系统进化分群鉴定分离株,并通过毒力基因检测、致病性试验及药敏试验对分离株的致病性和耐药性进行研究。【结果】死亡犊牛肺脏、肝脏、心血、关节液和肠系膜淋巴结以及健康犊牛肛拭子样品接种后菌落生长形态一致,结合选择性培养基上菌落生长形态、革兰染色镜检形态特点、生化特性及大肠杆菌16S rRNA的验证,鉴定分离菌株为大肠杆菌。系统进化分群试验中,KS-1为A群,KS-2为B1群。毒力基因检测结果显示,KS-1携带crl、papC、hlyE、eaeA、ompA、ompC、iucD和iutA共8种毒力相关基因,KS-2携带crl、hlyE和ompF共3种毒力相关基因。致病性试验结果显示,腹腔注射1×108 CFU分离株感染小鼠,KS-1组小鼠在16 h内全部死亡,KS-2组小鼠无死亡现象出现。药敏试验结果显示,KS-1对哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢呋辛等17种药物敏感,对氨苄青霉素/舒巴坦和哌拉西林中度敏感,对氨苄西林和复方新诺明耐药;KS-2对哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星和呋喃妥英敏感,对妥布霉素中度敏感,对其余14种药物耐药。【结论】本研究分离出2株犊牛源大肠杆菌,其中KS-1毒力较强,且携带丰富的毒力基因,对大部分常用抗生素敏感,对氨苄西林和复方新诺明具有耐药性;KS-2携带毒力基因较少,呈现多重耐药。

同位素稀释-液相色谱-串联质谱快速测定猪肝中4种β_(2)-受体激动剂残留

[目的]建立同位素稀释-液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)测定猪肝中沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺和氯丙那林的分析方法。[方法]样品经5%高氯酸水解后,加入固体缓冲剂,用乙酸乙酯-叔丁基甲醚(3∶2,V/V)提取,氮吹复溶后,正己烷净化,采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱分离。[结果]沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林在0.25~10.00μg/L线性良好(r≥0.9975);方法的定量限为0.50μg/kg。在3个添加水平下回收率为82.5%~109.7%,RSD为1.0%~12.2%。[结论]该方法灵敏、快速、准确,适用于猪肝中4种β_(2)-受体激动剂快速定性和定量筛查。

食源性沙门氏菌的分离鉴定与生物学特性分析

为了解新疆食源性沙门氏菌的血清型分布与耐药情况。按照国标GB4789.4-2016检测食品样品中沙门氏菌污染情况,鉴定血清分型,用VITEK-2 Compact(AST-GN13)药敏卡进行药物敏感性试验。结果显示:330份样本中沙门氏菌检出率为3.03%(10/330),其中肉制品中检出率达5.83%(7/120),粮食制品中检出6%(3/50)。血清型以德尔卑沙门氏菌为主。分离沙门氏菌株对头孢唑林、头孢替坦、阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的耐药率为100%,45.45%菌株对呋喃妥因显示为中介,36.36%对氨苄西林耐药,27.27%对氨苄青霉素/舒巴坦耐药。新疆地区食品中存在不同血清型沙门氏菌的污染,并且耐药性日趋严重。日常应加强食品卫生的监督检查和管理,在畜禽养殖过程中应严格监管抗生素的规范使用。