CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物抗病性改良中的应用综述

植物病害是影响作物生长的重要因素之一,对世界粮食安全构成很大的威胁,培育优良的抗病品种成为最优策略。CRISPR/Cas9基因编辑技术自问世以来备受关注,因该系统简单、高效、稳定的特点,逐渐成为分子育种领域重要的技术手段。本综述简单回顾了CRISPR/Cas9基因编辑技术的技术原理和在植物中的应用情况,系统总结了该技术在植物抗真菌、细菌和病毒方面的应用。还列举了可用于提高植物抗病性的基因位点以及真菌、细菌和病毒等病原物的致病相关基因位点编辑应用情况,探讨了该技术主要的优势和不足,以及未来应用的前景和挑战,以期为今后研究提供参考和借鉴。

新疆野生羊肚菌遗传多样性研究

本研究采用ISSR分子标记技术,对来自新疆5个不同地区25个地理居群的羊肚菌属190个个体的遗传多样性和遗传结构进行检测。结果显示,13条ISSR引物共检测到118个位点,其中多态性位点116个,多态位点百分率(PPB)为98.31%,Nei’s基因多样性(H)为0.2404±0.1637,Shannos’s多样性信息指数(Hsp)为0.3793±0.2173。群体水平上,各个群体的多态位点百分率(PPB)平均为41.99%,Nei’s基因多样性(H)为0.1527±0.1915,Shannos’s多样性信息指数平均为(0.2279±0.2767),ISSR标记同时揭示羊肚菌群体存在一定程度的遗传分化(Gst=0.3718),群体间的遗传变异占总变异的37.18%,群体内遗传变异占62.82%,遗传变异主要存在于群体内部。基因流(Nm)为0.8447,小于1.0,进一步证实野生羊肚菌群体存在一定程度的遗传分化。Mantel检测发现,群体间的遗传距离与地理距离具有一定的正相关关系(R=0.6277,P=0.0020)。羊肚菌属在物种水平表现出较高的遗传多样性,群体在进化上遗传变异减缓,遗传多样性较低。较广的分布范围,大尺度的地理跨度、特殊的生境等可能是导致羊肚菌属目前遗传格局的主要原因。

尖镰孢5-氧脯氨酸酶基因的鉴定及功能分析

【目的】5-氧脯氨酸酶(5-oxoprolinase,OXP)是γ-谷氨酰循环中6种核心酶之一。鉴定尖镰孢(Fusariumoxysporum)5-氧脯氨酸酶基因,明确其与尖镰孢致病力的关系,为解析尖镰孢致病分子机制以及棉花枯萎病防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法从尖镰孢基因组中鉴定FoOXP,分析其基因结构、编码蛋白的结构域、染色体定位及进化关系。通过基因敲除突变株和回补菌株分析FoOXP2突变后尖镰孢的表型,并检测突变株和野生型菌株对棉花幼苗的致病力差异。利用寄主诱导的基因沉默(host-inducedgenesilencing,HIGS)技术调查转化棉花的病级率及病情指数。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测棉花中真菌生物量和转化FoOXP2干扰片段的棉花茎中FoOXP2的表达量。【结果】在尖镰孢基因组中共鉴定出两个FoOXP(FoOXP1和FoOXP2),其编码序列长度分别为4080和3921 bp,分别编码1359和1306个氨基酸,蛋白质分子量分别为14.90和14.07kDa,理论等电点分别为5.73和5.30。FoOXP1蛋白定位于线粒体,FoOXP2蛋白定位于细胞骨架。FoOXP1位于染色体JH657921,FoOXP2位于染色体JH657938,未形成基因簇,其序列相似性为52.00%。系统发育分析发现,FoOXP1和FoOXP2分属于两个亚群。与野生型菌株相比,FoOXP2敲除突变株产孢量和孢子萌发率显著降低,穿透能力丧失,对刚果红和山梨醇的耐受力有所增强,但对细胞壁胁迫(SDS和CFW)、氧化胁迫(H_(2)O_(2))和渗透胁迫(NaCl和KCl)更敏感。同时,对棉花的致病力显著下降。HIGS结果表明,接菌14和21 d后,FoOXP2基因沉默后的棉花植株发病明显减轻,其病情指数(17.3和40.2)显著低于对照(28.2和77.1),FoOXP2表达量和真菌生物量显著低于对照。【结论】FoOXP2正向调控尖镰孢的致病力,推测其在宿主-病原体互作过程中发挥重要作用。

新疆野生羊肚菌物种多样性研究

根据子实体形态特征并结合r DNA ITS(Internal Transcribed Spacer)序列分析技术分析了根据形态特征挑选的、采自新疆伊犁、塔城、石河子、乌鲁木齐、阿勒泰五地区的31株野生羊肚菌子实体。r DNA ITS序列分析表明,采自新疆兵团185团且形态学分类为半开羊肚菌(Morchella semilibera)的2株菌株实为羊肚菌科常见属钟菌属的皱盖钟菌(Verpa bohemica)。以2株皱盖钟菌作为外类群,29株样品与来自Gen Bank的羊肚菌属各物种进行ITS序列聚类,可以分为四大聚类群,其中25株菌株与Morchella sp.Mel-17/19/20/34、Morchella sp.Mel-23/24/31/32、Morchella sp.Mel-13/26聚为第I类群;半开羊肚菌单独聚为第II类群;1株菌株与Morchella frustrata聚为第III类群;3株菌株与Morchella sp.Mes-6、Morchella sp.Mes-7、Morchella sp.Mes-17共同聚为第四类群。结合形态学特征,初步认为,上述五地区羊肚菌属至少由7个物种构成。根据国内最新研究资料,其中2种为中国新纪录种,分别为Morchella sp.Mes-17和Morchella frustrata(中立羊肚菌)。

新疆棉花枯、黄萎病的发生现状及其快速分离技术

为明确新疆不同地区造成棉花萎蔫,维管束变褐的病原菌种类及其发生现状,本研究对新疆47个主要植棉区有萎蔫症状且维管束变褐的棉花病株进行了分离鉴定,并对其快速分离鉴定方法进行了改进。结果表明:南疆20个地点,得到358个纯化菌株,黄萎病菌占81.8%,枯萎病菌占18.2%;北疆27个地点,得到495个纯化菌株,黄萎病菌占93.9%,枯萎病菌占6.1%。南北疆均以黄萎病为主,枯萎病南疆重于北疆。维管束病害的快速分离方法每分离一个样品只需2 min,污染率仅为6.7%。

新疆杂交棉育种及推广示范的研究进展与展望

新疆棉区目前已成为我国最重要的产棉区,近年来,该棉区选育的60多个常规品种的产量遗传改良不显著,出现徘徊现象,常规品种的增产幅度已经进入瓶颈期,利用常规种进一步提高单产的难度越来越大。杂交棉能够集中2亲本的优势,可将高产、优质和抗病三者结合,且组合选配周期短,能较快地提高棉花产量和品质,对于新疆棉花提质增效具有重要意义,因此,在新疆棉区开展杂交棉的育种、栽培示范以及推广应用研究对于提高新疆乃至全国棉花产量和改善纤维品质均具有重要战略意义。鉴于此,本文参考近年来国内外公开发表的文献资料以及深入新疆地方和团场连队调研数据,归纳总结新疆杂交棉育种、推广应用的发展现状,分析存在的问题,并对其发展趋势进行展望,以期为新疆杂交棉的发展提供理论参考资料。

CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhNAC3基因编辑

为创制棉花耐旱种质资源,解决棉花耐旱资源贫乏以及提高水资源利用率,研究依据CRISPR/Cas9编辑原理,对课题组前期利用RT-PCR技术筛选耐旱相关基因GhNAC3(Gh_D02G0790)的第一外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在陆地棉基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与gRNA-AtU6载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的AtU6-GhNAC3表达盒,再将表达盒连接到CRISPR/Cas9(pRGEB32-7)载体上,获得CRISPR-GhNAC3重组表达载体,利用农杆菌介导法转化陆地棉受体YZ-1,再生培养得到T_(0)代转基因幼苗,通过PCR检测Cas9蛋白基因获得阳性株系。对T_(0)代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定GhNAC3编辑类型。结果发现,CRISPR9-GhNAC3表达载体成功转化YZ-1,并获得40株转基因再生植株,经Cas9蛋白基因鉴定得到30株阳性株系,从阳性植株选择10株进行编辑类型测序分析,发现7株在靶点区域发生编辑,编辑类型主要为碱基片段缺失,缺失片段大小为3~28 bp,T_(1)代种植于大田,获得了同时出现黄化和矮化的突变体3株。

海岛棉类受体胞质激酶基因GbRLCK10在抗病中的作用

GbRLCK10为海岛棉响应黄萎病菌和激素胁迫基因。为研究该基因在烟草中的功能,利用农杆菌介导法将其导入烟草。对获得的阳性植株通过室内接种法进行抗病性鉴定,并利用qRT-PCR技术分析水杨酸途径关键基因NtPR1、NtNPR1和乙烯途径关键基因NtEIN4、NtNTHK2及茉莉酸途径关键基因NtJAZ1、NtAOS的表达特征。结果表明,接种前,转基因植株中NtPR1、NtNPR1、NtJAZ1基因的表达量显著高于野生型植株;而野生型植株中NtEIN4、NtNTHK2、NtAOS基因表达量显著高于转基因植株。接种黄萎病菌后,转基因植株的病情指数显著高于野生型;野生型植株感病后,NtPR1、NtNPR1、NtAOS基因的表达量显著高于发病前,而NtJAZ1、NtEIN4、NtNTHK2基因的表达量显著低于发病前;转基因植株感病后,NtPR1、NtNPR1、NtEIN4、NtAOS基因的表达量均显著高于发病前,而NtJAZ1、NtNTHK2基因的表达量均显著低于发病前;与野生型相比,转基因植株NtPR1、NtAOS基因的表达量显著降低,而NtNPR1、NtEIN4、NtJAZ1、NtNTHK2基因的表达量显著提高。综上所述,GbRLCK10基因通过调控激素途径中关键基因的表达水平影响烟草黄萎病抗性,为进一步揭示GbRLCK10基因对棉花黄萎病响应机制的功能研究提供了重要依据。

干旱胁迫对不同抗旱性棉花品种抗氧化酶活性及基因表达的影响

为明确不同抗旱性棉花品种对干旱胁迫的适应性差异,该研究选用‘新陆早50号’(耐旱型)和‘新陆早27号’(干旱敏感型)为材料,分析干旱及复水处理下两材料的活性氧产生、电解质渗漏、抗氧化酶活性变化,并分析部分抗氧化酶基因、渗透调节基因和转录因子在干旱胁迫下的表达谱。结果显示:(1)棉花叶片的电导率和MDA含量随着干旱胁迫的加强逐渐增加,复水后恢复;在干旱胁迫处理6和8d,耐旱型品种‘新陆早50号’的抗氧化酶活性显著高于干旱敏感型品种‘新陆早27号’。(2)基因表达谱分析显示,棉花超氧化物歧化酶基因(GhSOD)仅在干旱胁迫下表达,且2个品种间差异不显著,GhBADH、GhNCED和GhP5Cs及转录因子GhPHD1、GhPHD5、GhPHD6和GhPHD10在‘新陆早50号’叶片中的表达量均高于‘新陆早27号’。研究表明,耐旱型棉花品种较干旱敏感型在干旱胁迫下其体内的活性氧含量、电导率和MDA含量较低,抗氧化酶活性较高,并且其抗旱相关基因表达量也更高。

膜下滴灌和淹灌两种栽培模式下水稻光合生理特性的研究

以粳稻品系T-04和T-43为试材,通过盆栽控水试验,比较了在膜下滴灌和淹灌两种栽培模式下乳熟期叶片的光合色素含量、光合特性、叶绿素荧光参数和渗透调节物质含量的差异,分析了两种栽培模式下的水分利用效率和产量构成因素。结果表明,在膜下滴灌栽培模式下,2个水稻品系的水分利用效率显著高于淹灌,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均降低;最大净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度、蒸腾速率显著降低,表明光合速率下降受叶绿素含量和气孔的双重影响;表观量子效率、羧化效率、ΦPSII、电子传递速率、Fv/Fm均显著降低,说明光合色素含量降低导致PSⅡ反应中心捕光能力减弱和光化学转化效率降低,从而使叶片光合速率降低;可溶性糖、可溶性蛋白均显著低于淹灌栽培;丙二醛、脯氨酸含量高于淹灌栽培,说明滴灌栽培水稻植株的膜脂过氧化加剧,细胞膜系统受到一定程度的破坏,通过主动积累渗透调节物质,适应干旱胁迫。膜下滴灌栽培水稻单位面积有效穗数和结实率显著降低,导致最终减产。

新疆早熟陆地棉SSR标记遗传多样性及群体结构分析

为弄清新疆早熟陆地棉的遗传背景、群体结构及为进一步进行关联分析提供理论支持,运用SSR分子标记技术对41份新疆北疆地区近50年来选育及推广的早熟陆地棉品种进行遗传多样性及群体结构分析。结果表明,8对多态性较好的引物共检测到50个位点,其中多态性位点为33个,多态性比率为66%;PIC（多态信息含量）变幅为0.5680~0.7846,平均值为0.6462。聚类分析结果表明,41份新陆早品种在遗传距离为0.42时可划分为3类,多数品种属于第3大类群。群体结构分析表明,当K=4时,△K值最大,表明可将41份材料分为4个类群,每一个品种均属于4个类群,而不明显属于某一类群。新陆早系列在选育过程中,亲本的来源较为广泛,遗传背景较复杂;采用本系列品种作为亲本选育后续品种的概率较小,本研究结果将为后续进行关联分析提供相关数据。

棉花Trihelix转录因子GhGT29基因的克隆及功能分析

Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用,克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。本文依据生物信息学分析,采用RT-PCR方法从陆地棉中克隆了一个Trihelix转录因子基因,命名为GhGT29(Gen Bank登录号:JQ013097)。该基因最大开放阅读框(ORF)为1092 bp,编码363个氨基酸,预测分子量为40.9 k Da,等电点为5.45。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有1个Trihelix家族典型的SANT结构域。系统进化树分析表明,GhGT29属于Trihelix转录因子SH4亚家族,与拟南芥At SH4-like1、At SH4-like2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,GhGT29受高盐、干旱、低温胁迫和ABA诱导表达;GhGT29在陆地棉的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d(12 DPA)纤维中均有表达,其中在花中表达量最高,在茎中表达量最低。利用拟南芥原生质体系统进行分析,结果显示GhGT29主要定位于细胞核中,并且具有转录激活活性。以上结果表明GhGT29基因可能参与棉花逆境信号通路中对抗逆功能基因表达的调控。

不同栽培模式下水稻各生育期光合生理指标的比较研究

为明确膜下滴灌与常规水作栽培的光合生理差异。通过对膜下滴灌和淹灌2种栽培模式下,4个水稻品系(T-04、T-43、T-66、T-69)在分蘖、孕穗、抽穗、乳熟、蜡熟期倒一叶的光合色素含量、光合-叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性以及渗透调节物质含量等光合生理指标的测定分析。结果表明:滴灌模式下,4个参试材料在5个关键生育期的蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、光合速率(Pn)均低于淹灌,胞间CO_2浓度(Ci)总体上略低于淹灌,大部分时期差异不显著(P>0.05);叶绿素荧光参数、光系统Ⅱ有效量子产量(ΦPSⅡ)、最大荧光(Fm)、暗适应光系统Ⅱ最大量子产量(Fv/Fm)总体上低于淹灌,大部分时期差异不显著,最小荧光(Fo)高于淹灌,荧光淬灭系数(q P、NPQ)在2种栽培模式下差异不大,叶绿素含量、类胡萝卜素含量、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性总体上低于淹灌,超氧化物歧化酶(SOD)活性在2种栽培模式下差异不显著,丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量总体上高于淹灌,可溶性蛋白(SP)含量总体上低于淹灌,可溶性糖(SS)含量差异不显著。水稻膜下滴灌栽培整个生育期均无水层覆盖,可能受到水分胁迫,导致其整个生育期大部分光合生理指标均低于淹灌。

棉花种子活力劣变的差异蛋白质组学研究

该研究以新疆本地审定且大面积推广应用的陆地棉品种‘新陆早33’、‘新陆早36’、‘新陆早50’种子为研究材料,采用高温高湿(40℃,RH100%)人工老化方法获得不同活力种子,双向电泳分离‘新陆早50’活力劣变种子总蛋白并对差异蛋白点进行二级质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定分析,以明确棉花种子活力劣变过程中蛋白质组表达的变化,探讨棉花种子老化的分子机制。结果显示:(1)经人工老化获得不同活力水平的种子,经生活力检测发现‘新陆早50’的种子活力随老化时间的延长呈线性下降,可作为蛋白质组研究材料。(2)TCA-丙酮法分别提取‘新陆早50’对照和劣变种子的总蛋白,经2-DE分离,获得了分辨率和重复性较好的蛋白质组差异表达图谱,在等电点4~7、分子量14.4~97.4kD之间发现约350个肉眼可辨的蛋白点,其中上调2倍以上且达到99%统计学显著水平的差异表达蛋白点30个。(3)二级质谱分析发现,有29个蛋白点被成功鉴定,生物信息学分析和功能分类结果表明,与贮藏相关的蛋白有13个,免疫相关蛋白2个,脂代谢相关蛋白1个,能量代谢相关蛋白1个,肌动蛋白2个,功能未知蛋白5个,调控相关蛋白2个,次级代谢物1个,细胞修复防御相关蛋白1个,分泌性蛋白1个。研究认为,分离鉴定的29个差异蛋白的变化可能与棉花种子活力劣变有关。

棉花耐旱耐盐碱生理和分子机制研究进展

耐旱耐盐碱等抗逆性状新型棉花材料的培育是当前棉花遗传改良的研究热点。综述了干旱和盐碱对棉花的影响,棉花对干旱、盐碱胁迫的形态适应性及生理调节机制,耐旱、耐盐碱基因的克隆及其分子机制,转基因耐旱、耐盐碱棉花材料的抗逆性及应用研究进展,旨在为棉花的耐旱、耐盐碱研究提供理论支持。

南疆春大豆品种比较试验研究

对引进的10份春播大豆进行品种比较试验,研究春播大豆品种在南疆图木舒克地区的适应性及丰产性。采用随机区组试验,对参试品种的生育期、主要农艺性状、产量性状等指标进行分析,筛选出适宜在南疆地区推广种植的春播大豆品种。田间试验初步表明,JD-17早熟性最好,生育期为119 d;生育期短于125 d的品种有5个。公顷产达3000 kg以上的品种有3个,ZH-30的产量最高,为3889.1 kg/hm^2。ZH-30和FD-78可作为南疆地区春播大豆品种进行推广种植。

早熟、高产陆地棉新品种新垦棉2号的选育及栽培技术

介绍新垦棉2号选育过程、特征特性和栽培要点等。

早熟、高产陆地棉新品种新垦棉1号的选育及栽培技术

新垦棉1号是由新疆农垦科学院生物技术研究所和甘肃省农业科学院黄羊试验场联合选育的早熟、高产、优质陆地棉常规种,2018年1月通过甘肃省农作物品种审定委员会审定。简要介绍了其选育过程、特征特性和栽培要点。

海岛棉GbRLCK10基因克隆及表达分析

该研究以拟南芥抗逆基因At1g67520为探针,利用海岛棉ESTs数据库,通过电子克隆获得海岛棉RLCK家族基因GbRLCK10,解析该基因组结构,并结合qRT-PCR技术分析该基因mRNA的组织表达特征以及在不同胁迫诱导下的表达模式,为揭示RLCK家族基因在海岛棉中的表达调控及作用机制提供理论依据。结果显示:(1)获得海岛棉类受体胞质激酶(RLCK)基因,其开放阅读框(ORF)为1 179bp,编码392个氨基酸,具有典型的Serine/Threonine结构域,属于RLCK家族,与GaRLCK10(XP_017604046.1)亲缘关系较近,命名为GbRLCK10(登录号2022184),且该基因由5个外显子和4个内含子组成。(2)实时荧光定量(qRT-PCR)检测显示,GbRLCK10基因在抗病品种‘新海21’和感病品种‘新海14’的根、茎、叶中均有表达;当黄萎病菌诱导后,GbRLCK10基因在抗病品种中对于病原菌的响应时间早于感病品种,且对黄萎病菌响应更强烈,推测该基因参与棉花对黄萎病的响应;盐(NaCl)、干旱(PEG-6000)处理‘新海21’后,GbRLCK10基因在NaCl处理下响应时间要早于PEG-6000处理,但对PEG-6000处理响应更强烈;分别用4种激素处理‘新海21’后,GbRLCK10均能被诱导表达,且在水杨酸(SA)处理后表现为先增加后下降再增加趋势,在乙烯(ET)处理后表达量为持续上升趋势,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理后呈先升高然后下降的趋势,但GbRLCK10基因对赤霉素(GA3)响应不明显。研究表明,GbRLCK10基因具有RLCK基因家族典型特征,该基因随黄萎病菌、NaCl、干旱、激素处理时间推移而发生变化,推测GbRLCK10基因可能参与了棉花对黄萎病菌、NaCl、干旱、激素胁迫的应答反应,但其功能仍需进一步研究。

棉花GhTGA1与GhTGA9.2基因克隆及表达特征分析

为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9. 2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术,从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9. 2。生物信息学分析表明,2个基因开放阅读框(ORF)长分别为1 281,1461 bp,分别编码405,486个氨基酸。序列分析表明,2个基因均含有b ZIP和DOG1结构域,属于b ZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术进行表达特征分析表明,GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)诱导上调表达,水杨酸(SA)诱导后,在各处理时间点,该基因表达量均低于Mock,以上结果表明,GhTGA1基因可能通过参与乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信号通路调控棉花对枯萎病的抗性;枯萎病处理后,GhTGA9. 2基因在各时间点表达量均低于Mock,呈下调表达,但能被激素(ET、JA、SA)诱导上调表达。结果表明,GhTGA9. 2基因可能通过激素(ET、JA、SA)途径参与胁迫应答,通过对GhTGA1与GhTGA9. 2基因表达特征分析为后续研究提供基础。