两种胶浓度PCR-DGGE方法对不同处理羊粪低温沼气发酵优势细菌结构多样性的分析

利用PCR-DGGE方法分析不同菌剂处理对羊粪沼气发酵微生物种群多样性的影响,了解低温条件下(15℃)羊粪沼气发酵过程中优势细菌群落结构多样性变化规律,从而为北方地区冬季低温沼气发酵促进菌剂的筛选奠定理论基础。通过对不同发酵处理的羊粪沼气反应器中取样,采用溶菌酶法,分别进行沼液中总DNA的提取,总DNA经纯化后采用引物341F-GC和518R进行细菌16S r DNA基因V 3区PCR扩增,扩增产物进行两种胶浓度变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离并回收优势条带和变化明显的条带进行扩增、测序及系统进化树的绘制,分析其细菌结构多样性。序列比对的结果表明,羊粪沼气反应器中的优势细菌菌群为:回收的44条带中拟杆菌门(Bacteroidetes)占32%,变形菌门(Proteobacteria)占30%,厚壁菌门(Firmicutes)占36%。其中,在15℃条件下,反应器中细菌优势基因片段更为丰富均匀,存在相对稳定的优势种群,且各处理的优势菌的丰度比对照组中相应菌的丰度更强,存在差异条带,细菌种群变化明显,优势种群亦有所不同,主要有Clostridium sp.,Proteiniphilum sp.,Bacteroidales bacterium,Pseudomonas sp,Advenella sp.等,其中低温下菌剂处理的以梭菌属菌(Clostridium)表现有较高的丰度;而在30℃条件下,主要有Bacteroidales bacterium,Hydrogenophaga sp.,Pseudomonas sp,Clostridiales bacterium等,其中以噬氢菌属(Hydrogenophaga)Hydrogenophaga sp.表现有较高的丰度,条带多样性数量比15℃的要少,添加菌剂处理对细菌种群变化影响不明显。

棉秸秆自然腐解过程中细菌菌群多样性分析

【目的】分析棉秸秆在自然腐解过程中细菌群落组成和多样性,获得与棉秸秆腐解有关的优势细菌菌属,为秸秆腐熟菌剂的制备奠定基础。【方法】采用高通量测序技术,对棉秸秆自然腐解过程、不同时间样品中的细菌16S rDNA基因的V4区测序,利用生物信息学方法分析测序结果。【结果】测序共得到354 067条有效序列,2 111条OTU序列,腐解初期有268个菌属,中期有300个菌属,末期有325个菌属。菌群α多样性指数分析显示,随着腐解时间的延长,7 d以后菌群多样性增加,与起始时相比差异显著(P<0.05),而7～28 d菌群多样性差异不显著(P>0.05)。在整个堆制过程中始终存在的优势菌属包括鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、橄榄球菌属(Olivibacter)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌属(Devosia)、根瘤菌属(Rhizobium)。【结论】棉秸秆自然腐解过程中,在7 d时细菌群落多样性在属水平上与腐解起始阶段差异显著(P<0.05),随着腐解时间延长,菌落多样性趋于一致;在整个腐熟过程中始终存在五个优势属,功能预测为降解纤维素、木质素、果胶类物质以及提供氮素营养。

外源氮肥、磷钾肥对棉秸秆堆腐的影响

【目的】研究外源氮肥、磷钾肥对棉花秸秆腐解过程的影响,为棉秸秆肥料化、基质化利用提供理论依据。【方法】采用网袋堆制熟腐法,设置棉秸秆自然堆腐、棉秸秆添加氮肥(尿素)堆腐、棉秸秆添加磷钾肥(磷酸二氢钾)堆腐共3个处理,分别在堆腐的前期(0~7 d)、中期(7~14 d)、后期(14~21 d)、末期(21~28 d)取样,测定棉秸秆质量及纤维素、半纤维素、木质素含量,分析棉秸秆累积失重率和阶段失重率,以及3种纤维成分的累积降解率和阶段降解率。【结果】添加氮肥可提高棉秸秆累积失重率,比自然堆腐提高6.7%;添加磷钾肥后,棉花秸秆失重率比自然堆腐降低了6.3%。添加氮肥后棉秸秆的降解速率在堆腐初期与自然堆腐相比有明显下降,之后降解速率加快。自然堆腐和添加磷钾肥处理的降解速率在堆腐初期最快,中期有显著下降,之后缓慢上升。添加氮肥和磷钾肥均能提高纤维素、半纤维素和木质素的降解率。在堆腐末期,和自然堆腐相比,添加氮肥或磷钾对纤维素的累积降解率分别提高178.29%和47.82%;添加氮肥和磷钾肥对半纤维素的累积降解率基本相同,提高幅度在40.6%左右;添加氮肥和磷钾对木质素的降解率分别提高9.13%和59.6%。纤维素降解最快阶段,添加氮肥是出现在堆腐末期,磷钾肥是出现在堆腐后期,CK是出现在前期和中期。半纤维素降解最快阶段,3种处理都是在堆腐前期。木质素降解最快阶段则都出现在堆腐前期和中期。【结论】添加氮肥和磷钾肥均能促进棉秸秆堆腐的降解程度,氮肥降解程度要高于磷钾肥,氮肥对棉秸秆的降解趋势与CK和磷钾肥有不同之处。氮肥对纤维素降解的促进程度要高于磷钾肥;氮肥和磷钾肥对半纤维素降解的促进程度基本相同;磷钾肥对木质素降解的促进程度要高于氮肥,降解变化过程也不相同。

不同饲喂下棉铃虫肠道内生菌的分离鉴定及脱毒效果研究

【目的】本研究对比饲喂正常饲料和棉粕饲料下棉铃虫(Helicoverpa armigera)肠道中可培养微生物的异同,并对筛选菌株进行棉酚耐受及降解作用的研究,为棉铃虫肠道微生物在棉源饲料中的脱毒作用提供理论和实验支持。【方法】通过饲喂不同饲料、醋酸棉酚单一碳源微生物选择性培养,分离饲喂正常饲料和棉粕饲料下棉铃虫肠道可培养棉酚耐受性内生菌,并进行16S rRNA基因序列分析鉴定;在一定浓度的醋酸棉酚液体中培养,对菌株进行脱毒作用分析,复合配比后,研究棉铃虫肠道复合菌在棉酚降解中的效果。【结果】共计分离得到的32株菌株,其中17株细菌可能是新分类单元,其中14株为潜在新种,3株为可能的新属。饲喂正常饲料组棉铃虫肠道中分离出17株分属于3个门、10个属,饲喂棉粕饲料组棉酚虫肠道中分离出15株属于2个门、8个属。随着选择性培养基醋酸棉酚浓度的升高,饲喂棉粕饲料组肠道菌耐受100、300、500、1000 mg/kg醋酸棉酚的菌株数均比饲喂正常饲料组高。在所有的耐受菌株中棉酚降解率达到50%以上的有15株,对棉酚最高降解率达90.83%。在肠道菌复合降解棉酚实验中,棉铃虫肠道内生菌实验组对棉酚的降解率显著高于对照组(P<0.05),棉酚降解率最高为87.04%。【结论】本研究证明了棉铃虫肠道内生细菌中存在对棉酚具有较高降解能力的菌株,丰富了棉酚降解菌的菌种资源,并对复合菌在棉源饲料开发应用的潜力进行了初步研究,为棉源饲料中棉酚的生物降解提供了一条新途径。