早孕因子生物学活性的研究现状和应用前景

早孕因子(early pregnancy factor，EPF)是一种具有免疫抑制和生长调节作用的妊娠相关蛋白。因为它具有免疫抑制性，可抑制玫瑰花环形成，故通常用玫瑰花环抑制实验来检测。有报道EPF与分子伴侣10(Cpn10)有同源性，但它们又不完全相同，Cpn10在细胞内与Cpn60特异性结合辅助蛋白质正确折叠，EPF则作为细胞外蛋白发挥作用。实验表明除孕血清外，在患肿瘤的病人和动物血清中、小鼠肝脏部分切除后的鼠血清中也检测到了EPF，这说明它除了免疫抑制性外，还具有类似生长因子的作用。因此它在临床有很广泛的用途，本文就EPF的生物学活性及其在临床工作上的研究和应用前景做一综述。

p62敲除对细胞自噬的影响及其对泛素化修饰蛋白募集的作用

目的探讨p62敲除对细胞自噬及泛素化蛋白募集的影响。方法将野生型(Wild Type,WT)和p62基因敲除(p62 knockout,p62-KO)的大鼠肾上皮细胞(NRK)分别分为野生型阴性对照组(WT CT组)和野生型饥饿4 h组(WT Sta4 h组)、p62基因敲除阴性对照组(p62-KO CT组)和p62基因敲除饥饿4 h组(p62-KO Sta4 h组)。WT CT组和p62-KO CT组中加入普通培养基,对细胞进行空白对照处理;WT Sta4 h组和p62-KO Sta4 h组中加入饥饿培养基,对细胞进行饥饿4 h处理。免疫印迹法鉴定和检测p62基因的敲除及自噬体标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、泛素化修饰蛋白(Ub)的表达;电子显微镜观察自噬体形成;激光共聚焦显微镜法观察LC3蛋白阳性点状结构的数量。结果鉴定p62基因成功被敲除。饥饿处理4 h后,WT和p62-KO细胞中均能观察到自噬结构(包括自噬体和自噬溶酶体)。与WT CT组比较,WT Sta4 h组中LC3蛋白酯化和Ub蛋白表达水平升高(P<0.05),LC3蛋白阳性点状结构数量显著增加(P<0.01);与p62-KO CT组比较,p62-KO Sta4 h组中LC3蛋白酯化和Ub蛋白表达水平升高(P<0.05),LC3蛋白阳性点状结构数量显著增加(P<0.01)。结论p62参与细胞自噬并募集泛素化修饰蛋白,最终影响选择性自噬体底物的凝聚和降解。

RARβ在宫颈癌及癌前病变中的表达调控和意义

目的:宫颈癌组织中的维甲酸受体β(retinoic acid receptor beta,RARβ)基因启动子区发生异常甲基化,一般提示其抑制基因的转录表达。本研究从mRNA和蛋白质水平观察宫颈癌发生与RARβ表达调控的关系和意义。方法:选择妇女宫颈炎、宫颈内上皮瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈鳞癌患者,收集新鲜组织标本37例及石蜡包埋组织126例,采用定量RT-PCR及免疫组织化学方法鉴定RARβmRNA及蛋白质表达水平。结果:1)与宫颈炎相比,RARB基因在CIN和宫颈癌组织中的mRNA表达水平明显下降,但是CIN与宫颈癌之间没有统计学差异(P>0.05)。2)RARβ蛋白在宫颈上皮细胞核正常表达,少数病例出现"部分缺失"(8%),但是随着CIN和宫颈癌发病进程,不仅发生"完全缺失",而且其缺失频率逐渐增高(38%和57%),与宫颈炎比较有显著差异(P<0.01)。结论:在宫颈癌及癌前病变组织中,RARβ转录水平表达下调及蛋白质水平表达出现缺失,可能是肿瘤发生的重要标志。本结果为进一步研究该基因异常甲基化相关的机制,并建立宫颈癌的生物标志物体系提供了客观依据。

食管癌ECA109细胞中Survivin shRNA干扰对核因子κB表达的影响及调控机制

目的探讨Survivin作为基因表达调控因子,对核因子κB(NF-κB)基因的转录及蛋白水平活性的影响及与NF-κB的调控关系。方法采用Survivin短发夹RNA(shRNA)干扰技术,脂质体转染食管癌ECA109细胞,检测Survivin沉默效果,选择最佳转染浓度;半定量RT-PCR检测Survivin shRNA干扰后食管癌ECA109细胞中NF-κB及其通路的上游调控因子核因子κB抑制蛋白α(IKKα)、IKKβ表达变化;Western blotting方法检测NF-κB蛋白的表达变化;流式细胞术检测干扰之后食管癌ECA109细胞增殖、凋亡指数的变化。结果 Survivin shRNA干扰食管癌ECA109细胞后,Survivin mRNA和蛋白表达明显下调;NF-κB mRNA表达变化无明显差异,但其蛋白磷酸化水平降低,NF-κB上游因子IKKα、IKKβmRNA表达下调;食管癌ECA109细胞凋亡明显增加,G2期细胞比例增加,S期细胞减少,细胞周期受阻。结论 Survivin通过在转录水平影响IKKα、IKKβmRNA表达,调控NF-κB蛋白活化水平,提示Survivin在肿瘤信号调控网络中可作为一个新的基因表达调控因子。

HPV16编码蛋白与宫颈癌细胞内CALCA和TFPI-2表达的关系

目的:研究人乳头瘤病毒16(HPV16)编码蛋白的表达与宫颈癌细胞内CALCA和TFPI-2基因表达水平的关系,探讨依赖于HPV感染的宫颈癌发病机制。方法:设计与合成HPV16编码基因E6和E7序列特异性短发夹RNA(sh RNA)寡聚核苷酸片段,构建表达sh RNA的p RNAi载体,其中携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,以此感染HPV16阳性的Si Ha宫颈癌细胞,采用荧光成像和实时荧光定量PCR(q PCR)分析等方法,评价载体转染效率、抑制效率及候选基因转录表达水平的变化。结果:在激光共聚焦显微镜下,观察到释放绿色荧光的细胞群,转染成功;根据定量q PCR分析,HPV16编码基因E6和E7的m RNA表达水平明显下降,sh RNA表达载体转染产生抑制效率;CDK4和BCL-2 m RNA表达水平明显下降,推测抑制HPV基因转录后,可能抑制宫颈癌细胞生长,引起细胞周期停滞;抑制E7基因表达后,CALCA和TFPI-2 m RNA表达水平明显上升,而抑制E6基因表达后,对上述基因表达水平的影响不明显。结论:HPV16编码蛋白质E7可能引起宫颈癌细胞内CALCA和TFPI-2基因表达下调,此为揭示依赖于HPV感染的宫颈癌发病机制提供了依据。

乌鲁木齐地区维吾尔族人群脂联素基因核甘酸多态性+45T/G单核苷酸多态性与冠心病的相关性研究

目的探讨乌鲁木齐地区维吾尔族人群脂联素基因SNP+45位核苷酸T/G多态性与冠心病(CHD)的相关性。方法以196例冠脉造影证实为CHD的非糖尿病患者为CHD组,以124例健康者为对照组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析脂联素基因SNP+45T/G单核苷酸多态性与CHD的相关性。结果 CHD组TT、TG、GG基因型和T、G等位基因频率与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论脂联素基因SNP+45位核苷酸T/G多态性与CHD无明显相关,提示脂联素基因可能不是CHD的易感基因。

新疆和田地区维吾尔族肥胖体表测量指标与Ⅱ型糖尿病关系的研究

目的:研究新疆和田地区维吾尔族Ⅱ型糖尿病(T2DM)患者与正常人群体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)等体表测量指标的差异并探讨体重指数、腰臀比与T2DM的关系。方法:采用随机抽样的方法抽取符合实验条件的新疆和田地区维吾尔族常住居民,其中T2DM患者105名作为病例组,112名健康体检者作为对照组,开展问卷调查并进行体格检查及血糖检查。结果:T2DM患者的年龄、腰围、体重、身高、BMI、WHR,均明显高于对照组;T2DM组BMI1、BMI2、BMI3,WHR1、WHR2均明显高于对照组;BMI1、WHR1、WHR2组的T2DM患病率均明显高于对照组。结论:T2DM患者年龄、腰围、体重、身高、BMI、WHR可能均是T2DM的危险因素。

维吾尔族妇女宫颈癌人乳头状瘤病毒感染与人类白细胞抗原Ⅰ类基因表达缺失的关系及其意义

目的研究维吾尔族妇女宫颈癌中人乳头状瘤病毒（HPV）感染和人类白细胞抗原Ⅰ类（HIA—Ⅰ）家族基因HLA-A、B和C表达的关系，探讨HPV感染和HLA-Ⅰ类家族基因表达缺失在宫颈癌演进过程中的作用。方法收集维吾尔族妇女宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变（CIN）Ⅰ／Ⅱ／Ⅲ和宫颈鳞癌患者的新鲜组织标本共78例，提取总RNA，采用半定量RT-PCR方法鉴定HIA-A、B和C基因的mRNA表达水平。提取组织DNA，采用HPV通用引物和HPV分型芯片确定HPV亚型。结果HIA-A、B和C基因的总体mRNA表达缺失率随着宫颈病变的加重而增加，在宫颈炎组织内为1／12，在CIN及宫颈鳞癌分别占70．0％（14／20）和84．8％（39／46），在恶性程度高的低分化癌组织中高达90．6％（29／32），并与高危型HPV16感染呈正相关（r=0．803，P〈0．01）。结论HLA-Ⅰ类基因的表达缺失是维吾尔族妇女宫颈癌发生的重要标志，而HPV16感染可能是HLA—Ⅰ分子表达缺失的前提条件。

风湿性心脏病心房颤动患者左右心耳组织连接蛋白40和连接蛋白43mRNA水平的对比研究

心房颤动（房颤）是临床最常见的心律失常，然而造成这种心律失常的发生因素和维持因素尚不明确。缝隙连接是心肌组织动作电位扩布的主要物质基础，其每个通道由2个连接子耦合而成，每个连接子由6个缝隙连接蛋白（connexin,Cx）构成，Cx40、Cx43是人类心房细胞最主要的Cx。本研究观察风湿性心脏病（风心病）房颤患者左右心耳Cx40、Cx43mRNA表达水平的变化，

维吾尔族妇女宫颈病变组织中HPV感染与低相对分子质量蛋白酶体2和7基因启动子甲基化的关系

目的探讨维吾尔族妇女宫颈病变及其人乳头状瘤病毒（humanpa pillomavirus，HPV）感染与低相对分子质量蛋白酶体（low molecular-weight protein，LMP）基因启动子区甲基化水平的关系和意义。方法利用专业软件设计LMP2和LMP7基因启动子区含CpG岛特异性PCR引物，对SiHa宫颈癌细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰、目的片段扩增、质粒载体克隆和测序，确定该区域所含CpG序列甲基化情况；收集维吾尔族妇女正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）患者新鲜组织和石蜡组织标本78例，并提取DNA，采用Sequenom MassARRAYDNA技术平台（质谱分析），定量分析LMP2和LMP7基因启动子甲基化水平，同时以HPV分型芯片鉴定HPV亚型，分析基因甲基化与HPV感染的关系；应用RT—PCR和免疫组织化学方法检测LMP2、LMP7mRNA和蛋白的表达，并分析蛋白表达与基因甲基化的关系。结果LMP2和LMP7基因相应目的片段各含有22个CpG位点，在SiHa宫颈癌细胞基因组DNA中，只有LMP7有2个位点发生甲基化。宫颈病变病理过程伴随着LMP7基因CpG片段甲基化水平改变，其在CSCC和CIN组织的甲基化率（0．1864±0．0893和0．0728±0．0548）高于正常宫颈上皮组织（0．0652±0．0488），差异有统计学意义（P〈0．05）。随着宫颈病变的加重LMP7mRNA和蛋白表达逐渐下调，各组间表达差异具有统计学意义（P〈0．05），LMP7蛋白表达随着该基因甲基化率增高而降低（F=8．69，P=0．035）。而LMP2蛋白表达在3组间差异无统计学意义（P〉0．05）。HPV分型芯片检出12种HPV基因型，其中HPV16感染率构成比为52／78（66．7％），HPV16亚型阳性与宫颈病变进程及LMP7基因甲基化率升高趋势正相关（t=1．996，P=0．049）。结论LMP7基因启动子区CpG岛甲基化是一种宫颈癌病变特异性改变，与HPV16感染可能存在密切关系。

维吾尔族妇女宫颈病变及人乳头状瘤病毒感染与抗原处理相关转运体TAP1和TAP2基因启动子甲基化的关系

目的探讨维吾尔族妇女宫颈病变及人乳头状瘤病毒（HPV）感染与抗原处理相关转运体（TAP）基因启动子区甲基化水平的关系和意义。方法利用专业软件设计TAP1和TAP2基因启动子区含CpG岛特异性PCR引物，对宫颈癌SiHa细胞DNA进行亚硫酸氢盐修饰、目的片段扩增、质粒载体克隆和测序，确定该区域所含CpG序列的甲基化情况。收集维吾尔族妇女15例正常宫颈上皮、30例宫颈鳞状上皮内肿瘤形成（CIN）和33例宫颈鳞癌患者的新鲜组织标本共78例，提取DNA，采用MassArrayDNA技术平台（质谱分析）定量分析TAP1和TAP2基因启动子甲基化水平，同时以HPV分型芯片鉴定HPV亚型，分析基因甲基化与HPV感染的关系。结果（1）TAP1和TAP2基因相应目的片段各含23个和8个CpG位点，在宫颈癌SiHa细胞基因组DNA中，分别有5个和8个CpG位点发生甲基化。宫颈病变病理过程伴随着TAP1基因CpG片段甲基化水平的改变，其在宫颈鳞癌和CIN组织的甲基化率[（0．048±0．039）和（0．037±0．026）]高于正常宫颈上皮组织（0．035±0．029），差异有统计学意义（P〈0．05）。尽管TAP2基因甲基化水平也发生了相应改变，但其差异无统计学意义（P〉0．05）。HPV分型芯片检出13种HPV基因型，其中HPV16所占比率为66．7％（52／78），HPV16亚型阳性与宫颈病变进程及TAP1基因甲基化率的升高趋势呈正相关（X^2=6．08，P=0．039）。结论TAP1基因启动子区CpG岛甲基化是宫颈癌病变的一种特异性改变，与HPV16感染可能存在密切关系。

CFD基因在宫颈鳞癌及癌前病变组织中的表达水平及意义

目的利用维吾尔族妇女宫颈癌疾病资源，探讨宫颈鳞癌及癌前病变与补体因子D（complement factor D，CFD）表达调控的关系及临床意义。方法收集维吾尔族妇女宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）、宫颈内上皮瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ-Ⅲ及宫颈炎患者的新鲜组织标本72例及石蜡包埋组织切片82例，提取新鲜组织RNA，利用半定量RT—PCR方法，鉴定不同宫颈病变组织中CFDmRNA表达水平；利用免疫组织化学（sP）法，研究不同宫颈病变组织切片中CFD蛋白质表达水平变化。结果随着维吾尔族妇女宫颈病变进程，CFDtuRNA表达水平明显下调，CINII-Ⅲ或CSCC与宫颈炎相比，有显著差异（P〈0．05），但是CINII-III与CSCC之间无差异（P〉0．05）。通过免疫组织化学鉴定，发现CSCC组织的CFD蛋白质表达水平（22．7％）显著低于宫颈炎（55．6％，P〈0．05）和CINⅡ一Ⅲ（50％；P〈0．05），但CINII-III与宫颈炎的差异不显著（P〉0．05）。结论CFD转录表达下调或蛋白质表达水平下降与维族妇女宫颈癌发生有密切关系，可能成为肿瘤早期预警的分子标志物。

大鼠脑缺血-再灌注损伤后Beclin-1和LC3的表达及依达拉奉的干预作用

目的:检测大鼠脑缺血-再灌注损伤模型中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3在皮层和海马区表达以及依达拉奉的干预。方法:将SD大鼠(雄性)随机分为以下几组:假手术组、模型组、依达拉奉组。采用Zea Longa线栓法通过大脑中动脉阻塞2 h再灌注24 h制备脑缺血-再灌注模型,其中假手术组仅分离左侧颈总动脉。剂量为10 mg/kg的依达拉奉于再灌注前15 mim经腹腔注射。采用神经行为学评分评估大鼠脑神经损伤表现;TTC染色判断模型是否成功和脑部损伤程度;对大鼠神经元细胞进行HE染色,观察其在皮层和海马区的变化;免疫组化检测Beclin-1和LC3的表达。结果:脑缺血-再灌注24 h后,依达拉奉组神经行为学评分为(2.00±0.67),显著低于模型组的(2.50±0.53)(P<0.05)。模型组大鼠脑部观察到梗死灶出现,皮层和海马区神经元受损伤,依达拉奉组上述症状减轻。皮层区假手术组、模型组、依达拉奉组的Beclin-1阳性表达率分别为(11.08±0.85)%、(33.42±1.57)%和(25.61±1.39)%,模型组与假手术组和依达拉奉组比较差异都有统计学意义(P<0.05);海马区假手术组、模型组、依达拉奉组的Beclin-1阳性表达率分别为(10.34±0.21)%、(31.82±1.73)%和(22.74±1.26)%,模型组与假手术组和依达拉奉组比较差异都有统计学意义(P<0.05)。皮层区LC3的阳性表达率分别为(15.33±0.47)%、(39.72±1.73)%和(28.53±1.61)%,模型组与假手术组和依达拉奉组比较差异都有统计学意义(P<0.05);海马区LC3的阳性表达率分别为(13.74±0.37)%、(32.53±1.43)%和(25.38±1.23)%,模型组与假手术组和依达拉奉组比较差异都有统计学意义(P<0.05)。结论:脑缺血-再灌注后Beclin-1和LC3表达水平增加,而依达拉奉可能通过下调它们的表达减少自噬发生,减轻脑损伤。