用EgAgB8/3重组蛋白ELISA-双抗夹心法建立棘球绦虫感染犬粪抗原检测系统的研究

目的高纯度表达细粒棘球绦虫抗原B(EgAgB8/3)重组蛋白,制备抗EgAgB8/3重组蛋白的多克隆抗体,建立ELISA-双抗夹心法检测棘球绦虫感染犬粪EgAgB8/3天然抗原系统。方法对已构建好的pET32a-EgAgB8/3-E.coli BL21(DE3)Lys S原核细胞表达系统进行IPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。目的蛋白用His-Binding-resin纯化柱进行纯化并免疫动物,免疫血清总IgG采用硫酸铵沉淀法纯化,一部分总IgG用过碘酸钠法进行标记,另一部分作为固相载体结合抗体备用。以未标记的总IgG为ELSA-双抗夹心法的包被抗体,细粒棘球绦虫感染犬粪粗提蛋白为夹心抗原,以标记的IgG为最终底物。结果成功获得高纯度EgAgB8/3重组蛋白和高效价多克隆抗体,运用标记和非标记IgG建立的ELSA-双抗夹心法对棘球绦虫感染犬粪特异性抗原检测的敏感性和特异性分别为85.0%和95.7%。结论获得的EgAgB8/3重组蛋白具有较好的免疫原性,且免疫动物后制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。用EgAgB8/3重组蛋白EL-SA-双抗夹心法粪抗原检测系统的成功建立为棘球绦虫感染犬快速诊断试剂盒的制备提供了科学依据,此方法的稳定性和推广实用性将需用大量的流行病学调查资料进一步证实。

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析。从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E.coliDH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆。IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒。经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%。成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒,初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础。

细粒棘球绦虫抗原B8kDa亚单位在虫体发育过程中的阶段性表达研究

目的研究细粒棘球绦虫抗原B(EgAgB)8 kDa亚单位基因家族成员(EgAgB8/1、EgAgB8/2、EgAgB8/3、EgAgB8/4、EgAgB8/5)在虫体发育各阶段(虫卵、棘球蚴生发层、原头蚴及成虫)基因表达的差异,为包虫感染中间宿主和终末宿主的免疫学诊断筛选期特异性优势表达抗原。方法分别从细粒棘球绦虫成虫、虫卵、原头蚴和棘球蚴生发层提取总RNA,用Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase XL(TaKaRa,Japan)反转录成cDNA,根据EgAgB 5个亚单位(EgAgB8/1、EgAgB8/2、EgAgB8/3、EgAgB8/4、EgAgB8/5)序列设计跨越内含子的基因特异性引物。基因表达差异应用SYBR Green I荧光实时定量PCR(Real-ti me PCR)技术进行定量分析,并用内参对照基因actin II来标准化定量结果。结果荧光实时定量PCR结果分析,EgAgB8/1和EgAgB8/2在棘球蚴生发层大量表达(表达量为68.874和16.258),EgAgB8/3和EgAgB8/5在成虫阶段有大量表达(表达量分别为1 905.512和180.315),EgAgB8/4在成虫、虫卵和原头蚴中的表达量分别为0.001、0.088和0.102,均较棘球蚴生发层表达量(3.576)低。结论 EgAgB 5个亚单位的基因表达在虫体发育各个阶段显现出明显差异。EgAgB8/1和EgAgB8/2可作为包虫感染中间宿主免疫学诊断最佳候选目的抗原,而EgAgB8/3可作为包虫感染终末宿主免疫学诊断的靶抗原。EgAgB 5个亚单位的阶段差异表达可能与其虫体发育不同阶段特有的生物学功能有关,有待进一步研究。

鼠β-防御素2抗宫颈癌的实验研究

目的:建立BALB/c小鼠U14宫颈癌移植瘤模型,观察肿瘤生长情况,探讨mBD2对小鼠机体免疫功能的影响。方法:采用无内毒素质粒大抽试剂盒抽提pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2和pcDNA3.1(+)质粒DNA。将荷瘤小鼠随机分为5组,分别采用pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2质粒治疗,同时设立pcDNA3.1(+)、顺铂和PBS组对照;观察肿瘤生长状况、荷瘤小鼠存活时间,绘制小鼠生存曲线。结果:成功建立了BALB/c小鼠U14移植瘤模型。采用pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2、pcDNA3.1(+)治疗造模成功的荷瘤小鼠,结果显示:pcDNA组及PBS组肿瘤生长迅速,出现大范围出血、坏死,并于治疗后7d全部死亡;mBD2组与rmBD2组小鼠肿瘤生长相对缓慢,出现局部出血坏死等现象,至治疗2周,出现死亡,至治疗结束时,每组仍有3只小鼠存活,而Pt组小鼠肿瘤生长慢,小鼠生长较为活跃,至治疗21d,开始出现死亡,pcDNA和PBS组与mBD2组和rmBD2组及Pt组与mBD2组和rmBD2组生存时间比较,结果有统计学意义(P<0.05),mBD2组和rmBD2生存时间比较,也具有统计学意义(P<0.05)。结论:mBD2能够抑制移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。在抑瘤效果上,mBD2优于外加信号肽重组mBD2作用。

犬感染细粒棘球绦虫的诊断研究进展及展望

棘球蚴病（echinococcosis）又称包虫病（hydatiddisease）,是由棘球属绦虫的幼虫寄生于人、畜体内引起的一种严重危害人体健康和畜牧业发展的人畜共患病之一。能感染人类的棘球属绦虫有4种：细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）、

棘球绦虫感染犬粪抗原检测研究新进展

棘球绦虫(Echinococcus spp.)感染的犬目前是人畜棘球蚴病主要传染源,因此对感染犬的动态监测、合理驱虫治疗是预防和彻底消灭包虫病流行的关键性措施之一。近年来,为了克服槟榔碱导泻法鉴定虫种和虫卵以及检测血清特异性循环抗原及抗体等方法的不足,各实验室开始应用ELISA双抗夹心法,试图建立棘球绦虫感染犬粪抗原的快速检测系统。本文对犬感染棘球绦虫的特异性粪抗原检测技术的最新进展作一综述。

新疆细粒棘球蚴免疫诊断抗原B亚单位3基因的克隆及序列分析

目的确定细粒棘球蚴抗原B亚单位3(EgAgB8/3)的特性并为研究其免疫功能奠定基础。方法根据已报道的编码EgAgB8/3的基因序列(AF362442)设计引物,进行基因扩增,利用DNAstarProtean软件对该抗原进行分析。结果成功克隆到EgAgB8/3基因,扩增片段为207 bp;序列比对结果显示,新疆细粒棘球蚴EgAgB8/3基因与GenBank登录号为AF362442序列完全一致,同源性为100%。对该抗原分析认为具有潜在的抗原表位位点。结论细粒棘球蚴EgAgB8/3在对包虫病的免疫诊断上是较好的候选抗原,并为研究该蛋白的免疫功能及建立以EgAgB8/3抗原为主的包虫病终末宿主免疫诊断方法奠定了基础。

人体良、恶性病变p53、C-erbB-2、PCNA的异常表达免疫组化检测研究

目的 :检测 p5 3、C- erb B- 2与 PCNA的异常表达可能为区别不同组织良、恶性病变提供可靠客观的指标。 方法 :对 6 6 3例恶性肿瘤 (包括鳞癌、腺癌、黑色素瘤 )及 5 6 6例良性病变 (包括乳头状瘤、腺瘤及慢性炎病变 )组织 p5 3、C- erb B- 2及 PCNA表达进行免疫组化检测。结果:恶性肿瘤 p5 3、C- erb B- 2及 PCNA表达阳性的检出率分别为 6 2 .7%、85 .8%及 94.7% ,明显较良性肿瘤与炎性病变为高 (分别为 0～ 11% ,12 .8%～ 45 .5 %及 13.6 %～6 1.8% ) (P <0 .0 5～ 0 .0 0 1)。结论:抑癌基因 p5 3的突变、癌基因 C- erb B- 2的过度表达与扩增及 PCNA的过高表达是恶性病变的共同特征 ,可以作为诊断或区别诊断良恶性病变的重要分子标志。

细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coliBL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

细粒棘球绦虫AgB8/1重组抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板用基因特异性引物扩增EgAgB8/1基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此基因片段为依据,人工合成合成EgAgB8/1抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1重组蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约28 kDa处有表达条带。结论本研究成功构建了pET32a-AgB8/1原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

包虫病血清学诊断抗原研究进展

本文综述包虫病血清学诊断抗原的研究新进展,以及基因重组技术和合成肽技术方面的研究进展。强调确定和分离具有高度特异性和敏感性的新抗原组分是当前提高包虫病免疫诊断效率的关键。

调节性T细胞相关负性分子与感染免疫

调节性T细胞通过免疫抑制与免疫耐受机制影响疾病的发展。与调节性T细胞相关的CTLA-4、PD-1等负性分子在调节性T细胞的调节功能中起重要作用。本文拟对CTLA-4、PD-1和调节性T细胞的关系以及在病毒感染、细菌感染、寄生虫感染等免疫病中的调节机制作一综述。

细粒棘球蚴Eg95重组蛋白表达及其血清学反应的研究

目的诱导表达和纯化细粒棘球蚴Eg95抗原重组蛋白,对其与CE病人血清学反应情况进行研究。方法IPTG诱导pET28a-Eg95原核表达质粒,表达和纯化Eg95重组蛋白,SDS-PAGE电泳对其进行初步鉴定,Westernblot法检测其与中间宿主CE病人血清学反应情况。结果pET28a-Eg95重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE电泳显示相对分子量约为15kDa。Westernblot结果表明,pET28a-Eg95重组蛋白能被CE病人血清识别,11例CE病人血清中8例呈阳性反应。结论细粒棘球蚴Eg95抗原存在于中间宿主CE病人体内,Eg95蛋白作为保护性抗原可能成为CE病人术后辅助性治疗的手段之一。

pTWIN1-EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的表达获得较纯的细粒棘球绦虫AgB8/3重组抗原(rEgAgB8/3)。方法根据GeneBank登陆号(AF362442)下载目的基因核酸序列,利用DNAman软件设计引物,对EgAgB8/3编码分泌型多肽片段的核酸序列进行PCR扩增,测序鉴定其正确性后定向连入原核表达质粒pTWIN1上,并转化至大肠杆菌ER2566,IPTG诱导表达CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白后进行纯化,用SDS-PAGE电泳和western blot分析鉴定融合蛋白与目的蛋白rEgAgB8/3的表达量和纯度。结果成功克隆获得EgAgB8/3基因目的片段和具有蛋白自剪切功能的重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,并鉴定其表达的融合蛋白主要以可溶形式存在;构建的重组载体中融合标签的几丁质结合域(CBD)和内含肽(intein1)分别使亲和层析纯化和融合标签自剪切一步完成。结论成功的构建重组表达载体pTWIN1-EgAgB8/3,获得高表达融合蛋白CBD-intein1-EgAgB8/3,并经简单后续处理即可获得含极少任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白rEgAgB8/3,尽可能保证了其原有的结构和活性,为抗rEgAgB8/3特异性单克隆抗体的快速制备奠定了基础。

小鼠beta防御素2原核表达与抗菌作用的初步研究

构建小鼠β-防御素-2(mouse beta defensins 2,mBD2)原核表达质粒pET32/mBD2,进行蛋白诱导表达及纯化,测定并纯化蛋白的抗菌活性。旨在为进一步研究其生物学特性奠定基础。通过腹腔注射脂多糖(lipopoly-saccharide,LPS)建立小鼠急性时相反应,采用RT-PCR方法扩增mBD2成熟肽,经KpnI和XhoI双酶切后插入相同酶切的pET-32a(+)载体,构建的重组质粒。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白。将融合蛋白采用肠激酶酶切、洗脱并用滤纸片法测定目的蛋白的抗菌活性。成功构建了原核表达质粒pET32a(+)/mBD2,并转化工程菌BL21(DE3)。在0.25 mmol/L IPTG、30℃诱导4 h条件下获得的融合蛋白。采用抑菌试验证实蛋白具有一定的抑制革兰阳性菌及阴性菌生长的作用。本研究成功构建了pET32/mBD2原核表达质粒,得到了在大肠杆菌中稳定表达mBD2蛋白。

犬细粒棘球绦虫感染LAMP检出日期的确定

目的确定犬细粒棘球绦虫感染环介导等温扩增技术(LAMP)最早检出日期。方法家犬8只,口服喂饲细粒棘球绦虫原头节,建立细粒棘球绦虫感染动物模型。感染后40d收集犬粪,用LAMP检测粪便中细粒棘球绦虫目的基因并与传统的PCR比较。结果 8只犬均获得细粒棘球绦虫感染,感染后第18dLAMP法检查犬粪中细粒棘球绦虫目的基因均阳性,较普通PCR法提早2d。结论 LAMP法简便、快捷、灵敏,有望成为早期诊断犬细粒棘球绦虫感染的重要手段。

LAMP法应用于寄生虫感染检测的研究进展

环介导等温扩增(LAMP)技术是近年来发展迅速的一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统PCR方法相比,LAMP技术属于等温扩增,无需昂贵的热循环仪,并且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀,扩增产物可不经过电泳,无需开盖直接通过肉眼观察即可判定结果,在反应前、后加入染色剂效果更佳。LAMP技术敏感性高、特异性强、操作简便,能够满足现场和条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。近年来LAMP技术在寄生虫感染检测中应用广泛,本文对其研究进展进行了综述。

细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原的表达及血清学诊断价值的比较

目的诱导表达并纯化细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原,比较两个重组蛋白对囊型包虫病(CE)的血清学诊断价值。方法 IPTG诱导转染至E.coliBL21(DE3)LysS的pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组原核表达质粒,表达和纯化EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白,并通过超声裂解法进行纯化,以CE病人及囊虫病人血清为一抗,Western blot法检测两个重组蛋白免疫反应性。结果细粒棘球绦虫重组抗原pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组原核表达质粒得到成功诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,重组蛋白分子质量单位为28 ku和38 ku;Western blot结果表明,EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白均能被CE病人血清特异性识别,16份CE病人血清中,以EgAgB8/1重组蛋白为抗原时11份阳性,以EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白为抗原时13份阳性;用EgAgB8/1和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白检测12份囊虫病人血清,分别有5份和3份阳性。结论 EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白具有抗原特异性,对囊型包虫病的血清学诊断价值优于EgAgB8/1重组蛋白。