两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征

背景:目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在对细胞表面标记识别的基础之上,包括单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等,但操作复杂,价格昂贵。目的:观察两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征。设计、时间及地点:开放性实验,于2008-03/2009-03在新疆医科大学干细胞研究室完成。材料:10例羊水标本来自怀孕16～22周行产前诊断或自愿引产的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得20～40mL羊水。方法:采用改进的两步培养法分离和培养人羊水间充质干细胞,首先同一步法将羊水标本离心、接种、培养至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落。然后将上清培养液转移至新的25cm2培养瓶中继续培养,至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落且达70%汇合后消化,改用α-MEM培养基,同样添加碱性成纤维细胞生长因子,接种培养,记为第1代。主要观察指标:①原代及传代羊水间充质干细胞形态学变化。②羊水间充质干细胞细胞核型、细胞周期、生长曲线和集落形成能力测定。③流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测表面抗原和细胞因子。结果:实验成功分离、培养和传代人羊水间充质干细胞。①孕中期羊水细胞原代培养平均7d可见散在的梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落;传代细胞在12h内完全贴壁,经过一两天潜伏期后增殖迅速,培养六七天可达90%融合,细胞排列有一定的方向性,呈漩涡状、辐射状排列,细胞为长梭形,相互之间界限不清。②两种方法得到的羊水间充质干细胞染色体核型为正常二倍体核型;生长曲线均呈S形,但两步法在第(6.1±0.5)天就达到高峰,显著快于一步法第(7.2±0.6)天(P=0.035)。流式细胞仪检测结果显示两步法羊水P3细胞S期细胞占(14±2.3)%,显著多于一步法(9.0±1.4)%(P=0.031)。两种方法获得的羊水间充质干细胞低密度种植7d后,均可形成散在的细胞集落,但两步法集落形成率为(15.0±2.3)%,显著多于一步法(10.0±1.8)%(P=0.021)。③流式细胞仪检测结果显示,羊水间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105,而CD34、CD45、HLA-DR阴性;免疫荧光检测表明羊水中含有Oct-4阳性细胞,但两步法羊水间充质干细胞中Oct-4阳性细胞比例为(1.2±0.3)%,显著高于一步法(0.9±0.2)%(P=0.041);RT-PCR分析表明两种方法获得的羊水间充质干细胞均表达Oct-4。结论:人羊水中也存在间充质干细胞,两步培养法是一种高效、简便实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法。

SD大鼠羊水间充质干细胞向神经样细胞体外诱导分化

目的:探讨体外诱导羊水间充质干细胞(AF-MSCs)分化成神经干细胞.方法:10只SD怀孕大鼠,180-240g,胎龄16d,过量腹腔麻醉致死,开腹全部切除子宫,在无菌的条件下抽取全羊水,采用贴壁法分离AF-MSCs,体外培养扩增,观察细胞生长特性,流式细胞仪检测AF-MSCs表面抗原表达及细胞周期.取第3代AF-MSCs,加入预诱导液(DMEM/F12、100mL/LFBS、1mmol/Lβ-MEM)诱导24h,然后加入诱导液(DMEM/F12、100mL/LFBS、5mmol/Lβ-MEM)诱导24h,最后在分化维持培养液(DMEM/F12、20μg/LEGF、20μg/L bFGF)中培养,行免疫荧光染色,检测NSE和GFAP的表达.结果:成功分离、培养和传代SD大鼠AF-MSCs,流式细胞术检测提示大鼠AF-MSCs的G0/G1期细胞比例约为87.5%、S+G2+M期比例为12.5%,表达CD44为98.3%、CD29为70%、和CD105为33.2%、不表达CD45为0.5%,CD34为1%,DLA-DR(MHCclassⅡ)为0.1%.诱导后,AF-MSCs能表达神经细胞标示物NSE和GFAP,且可在体外继续存活2wk左右.结论:羊水中也存在MSCs,与其他来源的MSCs特点相符;羊水可以作为一种新的胎儿MSCs来源,而且能在体外诱导分化为神经细胞.

超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察超低温冻存对人羊水间充质干细胞(AF-MSC)生物学特性的影响。方法通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水,分离培养出人AF-MSC。将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测,观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响。结果第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异(P>0.05)。结论短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响。

两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的建立两步培养法分离培养人孕中期羊水间充质干细胞（Mscs）的方法，观察羊水MSCs向神经元样细胞的诱导分化。方法采用改进的两步培养法分离和培养人羊水MSCs，以p巯基乙醇诱导其向神经元样细胞方向分化；并使用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫细胞化学法研究人羊水MSCs的生物学特性。结果成功分离、培养和传代出人羊水MSCs。流式细胞术检测人羊水MSCs表达CD44、CD29、CD105，不表达CD45、CD34、人白细胞DR抗原（HLA—DR）；免疫荧光法和RT—PCR检测表明，部分人羊水MSCs表达转录因子Oct一4。两步培养法羊水MSCs集落形成率[（15．0±2．3）％]和Oct一4阳性细胞率[（1．2±0．3）％]均高于一步法[分别为（10．0±1．8）％，（0．9±0．2）％，P均〈0．053。羊水MSCs经p巯基乙醇诱导后细胞形态发生改变，伸出突起并呈神经球样改变；免疫细胞化学法检测显示（54．76±3．65）％的细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE），同时（36．28±4．27）％的细胞表达神经胶质酸性蛋白（GFAP）。结论人羊水中存在MSCs，两步培养法是一种高效、简便、实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法。在体外条件下，利用β-巯基乙醇和适宜的培养液可使羊水MSCs定向分化为神经元。

体外诱导人羊水间充质干细胞向成骨细胞分化

目的:分离培养人羊水间充质干细胞(AF-MSCs)及向成骨细胞诱导分化。方法:采用两步培养法分离和培养人AF-MSCs,应用化学诱导法向成骨细胞诱导分化。结果:成功分离、培养和传代人AF-MSCs,部分人AF-MSCs表达Oct-4。两步培养法AF-MSCs集落形成率和Oct-4阳性细胞率均高于一步法。AF-MSCs经成骨诱导后von Kossa法测定可见钙结节呈黑色,碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论:人羊水中存在MSCs,两步培养法是一种高效、简便实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法。AF-MSCs易诱导分化为成骨细胞,且增殖快,成骨能力强。