钙离子信号蛋白TRPC1及Orai1参与了HUVEC经SOC和ROC介导的钙内流和NO生成

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)及钙释放激活钙通道调节分子1(Orai1)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导的Ca2+内流和一氧化氮(NO)生成中的作用。方法取2~3代HUVEC进行随机分组,将构建的TRPC1、Orai1干扰质粒(sh TRPC1、sh Orai1)分别转染入HUVEC,采用real-time PCR和Western blot检测TRPC1、Orai1 mRNA和蛋白的表达及转染抑制效率。将各组细胞分别与钙敏感受体(CaR)激动剂精胺、ROC模拟剂(TPA)+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220与经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育后,荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO生成的变化。结果与对照组比较,sh TRPC1组和sh Orai1组mRNA表达(抑制率分别为84.50%、76.10%)和蛋白的表达(抑制率分别为83.98%、71.73%)明显降低(P<0.05)。在4种不同药物作用下,sh TRPC1组和sh Orai1组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05)。结论 TRPC1、Orai1参与了人脐静脉内皮细胞SOC和ROC介导的钙内流和NO生成。

STIM1/ORAI1复合体参与调节人脐静脉内皮细胞SOC和ROC介导的钙内流和NO生成

为研究基质交联分子1(STIM1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca^(2+)内流和NO生成中的作用。采取2-3代HUVECs随机分组,将构建的STIM1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs。用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,Real-time PCR和Western blotting检测STIM1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达。细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组(Control组)及空质粒组(Scrambled组),将上述3组细胞分别与四种不同处理因素刺激后用荧光探针Fura-2/AM检测[Ca^(2+)]i变化,NO荧光探针DAF-FM负载方法同步检测NO生成的变化。随后将构建的STIM1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVECs,与Ca R激动剂精胺孵育后检测[Ca^(2+)]i和NO,用免疫共沉淀法检测STIM1和ORAI1的相互作用。结果显示,(1)与对照组相比,STIM1及ORAI1组,m RNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05);(2)在4种不同处理因素作用下,STIM1及ORAI1转染组中[Ca^(2+)]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);(3)与对照组及单转染STIM1及ORAI1组比,共转染组[Ca^(2+)]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);(4)STIM1与ORAI1相互作用形成复合体,且在Ca R激动剂的剌激下相互作用增强。由此可知,STIM1与ORAI1复合体共同调节Ca R经SOC和ROC激活介导的Ca^(2+)内流和NO生成。