新疆克里米亚-刚果出血热病毒株S基因分子生物学特性研究

目的对新疆地区2005年分离自亚洲璃眼蜱的3株克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒株进行S基因序列测定并分析比较该病毒的分子生物学遗传特性。方法应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒基因组S片段,纯化后直接测定其核苷酸序列,用DNASTAR软件对测定的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行比较分析。结果3株病毒s基因都由1673个核苷酸组成,开放阅读框均为1449个核苷酸,编码482个氨基酸,3株病毒间核苷酸及氨基酸同源性序列为99．5％,与其他已发表的9株CCHF病毒株的核苷酸序列同源性在92．7％-99．8％之间。这3株病毒与已分离的7001和79121株同属1个基因组,序列相差2％-3％之间。与尼日利亚的原型株IBAR10200的差异性为13％,远大于与中国原型株66019之间的6．8％的差异。结论中国株为相对独立的一个类群,新疆自治区境内不同地区分离的CCHF病毒S基因分子结构差异相对较小。

昆虫抗冻蛋白的结构与生物学特性研究

抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs)是一类抑制冰晶生长的蛋白质,它能以非依数性形式降低溶液的冰点而对其熔点影响甚微,因而也被称作热滞蛋白。近几年来对于昆虫抗冻蛋白的研究取得了较快的发展,已有20多种昆虫抗冻蛋白被分离纯化。就昆虫抗冻蛋白的结构特征、生物学特性以及在农业、医学和食品工业等方面的应用进行介绍。

检测抗冻蛋白生物学活性两种方法的比较

为了比较两种方法测定昆虫抗冻蛋白生物学活性的优劣．通过抗冻蛋白细菌低温保护实验测定菌液OD500和菌落计数两种方法同时研究洛氏脊漠甲抗冻蛋白对大肠杆菌的低温保护效果，实验表明发现这两种方法所得结果相近，相关系数r=0.82～1．0，相关性显著（p〈0．05）．菌落计数法的误差小NOD值法，适用于菌落数少的情况，OD值法适用于菌落密度大的情况，两种方法都可用于研究抗冻蛋白低温保护活性.

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因的克隆和抗冻活性分析

根据GenBank中已发表的昆虫抗冻蛋白基因的保守序列设计引物,利用RT-PCR技术结合3’-RACE扩增的方法,从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲Microderapunctipenisdzunarica中获得了长约294bp不含信号肽的抗冻蛋白cDNA片段,命名为MpAFP5,其全长序列为363bp(GenBank注册号为AY821792)。基因测序结果表明,MpAFP5cDNA片段与加拿大拟步甲DendroidescanadensisAFP8基因片段、黄粉甲TenebriomolitorTHP4-9基因片段的核苷酸同源性分别达68.4%和71.8%,氨基酸序列同源性分别达70%和81%。将MpAFP5构建到原核表达载体pGEX4T-1中,重组质粒pGEX4T-1-MpAFP5在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达融合抗冻蛋白,SDS-PAGE分析显示融合蛋白的分子量约为37kD,Western印迹分析证明MpAFP5在大肠杆菌中正确表达。细菌的抗冻实验结果显示准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白对细菌具有显著的抗冻保护作用,保护效果与抗冻蛋白剂量呈正相关性。

新疆3种藜科盐生植物NHX基因的克隆与序列分析比较

从新疆野生植物盐角草(Salicorniaeuropaea)、盐爪爪(Kalidiumfoliatum)和盐穗木(Halostachyscaspica)中分别克隆了约1.7kb的NHX基因cDNA片段,此片段均包含了NHX完整基因,三者之间有较高的同源性,盐角草NHX基因与盐爪爪NHX基因同源性达92.81%,盐角草与盐穗木同源性达92.19%,盐爪爪与盐穗木同源性达97.66%。它们与其它几种藜科盐生植物如滨藜、碱蓬、灰绿藜的NHX基因同源性也很高,达到80%以上,与拟南芥同源性也达到86%。此基因在植物尤其是藜科盐生植物中高度保守,其编码的功能性蛋白可能在影响植物耐盐中起作用。

新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ与细菌DNA相互作用的光谱研究

抗菌肽的抗菌机理研究主要集中在抗菌肽与细菌细胞膜作用方面,抗菌肽是否与细菌的染色体DNA作用尚不清楚。为了探讨新疆家蚕抗菌肽Cecropin-XJ抗细菌的作用机理,利用紫外光谱及以溴化乙锭(EthidiumBromide,EB)为荧光探针的荧光光谱方法研究抗菌肽Cecropin-XJ与金黄色葡萄球菌DNA在体外的相互作用,计算获得抗菌肽与DNA的结合常数和成键位点数。结果显示,抗菌肽使DNA发生了明显的增色效应,并使DNA的荧光强度增强,抗菌肽能与EB竞争性的结合DNA,表明抗菌肽可能与DNA双螺旋的沟槽结合;在抗菌肽存在下,DNA与EB作用的结合常数和成键位点数都发生变化,表明抗菌肽以嵌入和非嵌入两种方式与DNA相互作用。文章从分子水平上初步阐述了抗菌肽与细菌DNA的作用模式和结构特征,为深入研究抗菌肽的作用机理奠定了基础。

植物分子水平的耐盐机制

从盐过敏感调控途径、离子分室效应、胁迫反应转录因子及胁迫对基因表达的调控等方面综述了植物的抗盐机制 。

新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)特性的研究

探讨了新疆家蚕抗菌肽 (Cecropin -XJ)的抗菌特性。根据琼脂糖孔穴扩散法 ,检测抗菌肽的热稳定性、抑菌效价、对氨苄青霉素抗性菌的抑菌作用 ,检测抗菌肽对酸碱盐、人造胃液的耐受性及其抗菌谱。结果表明新疆家蚕抗菌肽 (Cecropin -XJ)具有很强的热稳定性、能够杀灭氨苄青霉素抗性菌、对酸碱盐、人造胃酸有一定的耐受性 ,其杀菌活力为 :1μg/ μl抗菌肽与 2 4 0 0 0单位的氨苄青霉素杀菌活力相当。新疆家蚕抗菌肽能够杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 ,而对革兰氏阳性菌的抗菌活力高于革兰氏阴性菌 ,这一发现将为抗菌肽在农业、医疗卫生、畜牧业等方面的应用奠定基础 。

赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测

根据GenBank中序列人工合成赤翅甲 Dendroides canadensis 的抗冻蛋白基因 (afp), 将其克隆到载体 pGEX_4T_1上, 构建融合表达的重组质粒, 转化大肠杆菌 BL21并进行原核表达。通过优化表达的诱导条件和SDS_PAGE检测, 证明人工合成的赤翅甲抗冻蛋白基因能够特异性地表达, 并以可溶性融合蛋白形式存在, 相对分子质量约为40 kD。抗冻蛋白的生物活性检测表明, 赤翅甲的抗冻融合蛋白能够提高细菌的耐寒能力。

新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16型E6基因突变分析

背景与目的:高危型人乳头状瘤病毒16和18(humanpapillomavirustype16and18,HPV16,HPV18)是宫颈癌主要病因之一,尤其以HPV16最为常见,其中HPV16E6是主要癌基因之一。在一些地区,特定的E6基因突变株是宫颈癌发生的危险因素。新疆南部维吾尔族聚居区是宫颈癌高发区,我们已在前期的研究中发现该地区HPV16E6基因发生突变,本研究旨在检测该突变在新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌组织中的分布规律,并探讨其与该地区宫颈癌高发的关系。方法:从35例中国新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌活检标本中提取组织DNA作为模板,PCR扩增HPV16E6全长基因,PCR产物直接测序或克隆后测序,分析新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPV16E6基因的突变。结果:PCR检测结果表明宫颈癌组织中HPV16E6阳性率为82.86%(29/35);26例中E6分离片段的测序和序列分析表明,15例(57.69%)分离株E6基因与原型相同,另有11例(42.31%)E6基因突变,其中9例(34.62%)分离株发生了L83V突变,2例(7.69%)分离株发生了L83V/D63E突变。结论:中国新疆南部地区HPV16E6基因发生变异,其原型和变异型在该地区维吾尔族宫颈癌患者中的分布规律可能与该地区宫颈癌高发存在一定关系。

骆驼蓬种子提取物及其β咔保啉生物碱对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用

目的探讨去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱、骆驼蓬总碱及哈尔满碱(止咳药用植物)对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用。方法从体外培养的Q3肝癌细胞中,提取分离DNA拓扑异构酶Ⅱ;以阿霉素为阳性对照,用琼脂糖凝胶电泳法检测药物对DNA拓扑异构酶Ⅱ的作用。结果骆驼蓬总碱、去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱及哈尔满碱对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性均有一定的抑制作用。结论对DNA拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用是骆驼蓬总碱、去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱等生物碱抗癌作用和细胞毒作用的机制之一。

新疆盐生植物的钙调蛋白基因克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆盐生植物花花柴(Karelinia caspica)、盐爪爪(Kalidium foliadum)和盐桦(Betulahalophila)中分别克隆获得了450bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析的结果表明,所克隆的基因片段均包含了钙调蛋白基因完整的读码框架。新疆花花柴钙调蛋白基因与盐爪爪钙调蛋白基因同源性达86%,盐爪爪与盐桦同源性达86.77%,花花柴与盐桦同源性达85.11%。新疆盐生植物钙调蛋白基因与其它已发表的植物钙调蛋白基因同源性均在80%以上,显示植物钙调蛋白基因具有高度保守性。

新疆濒危植物盐桦试管苗生根培养的研究

采用L27(313)正交试验方法探讨了培养基种类A、植物生长调节剂及其不同浓度配比B、蔗糖量C、培养的光照条件D四因素对诱导盐桦生根(平均根长、生根系数、生根率)的影响。结果表明,生长素B、生长素×培养基(A×B)对生根系数有极显著的影响,培养基A、生长素B、生长素×培养基(A×B)仅对平均根长有极显著的影响,四个因子对生根率均无显著的影响。研究获得诱导盐桦平均根长的优化培养基为A2B1C3D1(即S27处理)MS+NAA 0.2 mg/L+蔗糖10 g/L+琼脂7%,诱导盐桦生根系数优化培养基为A3B2C3D2(与处理S21的A3B2C3D3相似)1/2MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7%+暗光处理3 d,诱导盐桦生根率的优化培养基为A2B3C1D1(即S10处理)MS+IAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7%。最佳生根培养基为:1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7%+暗光处理3 d。其生根系数高达5.308,生根率高达96.30%以上。

新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用酵母Pichia pastoris 蛋白表达系统,表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。方法:根据新疆准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP5)基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoRI和SalI酶切位点,经PCR扩增MPAFP5基因成熟肽序列后与pGEX4T-1载体相连,再将MPAFP5从pGEX4T-1 载体上切下亚克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-MPAFP5,经线性化后采用电转化法将重组穿梭质粒转入酵母细胞SMD1168内,Zeocin+筛选鉴定重组子,小瓶发酵后取上清作SDS-PAGE检测,并用Western-blot检测表达蛋白的正确性。结果:MPAFP5成功地在酵母表达系统获得表达,Western-blot检测表明表达产物为准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白。结论:酵母表达系统能够高效表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白,为高密度发酵大量生产抗冻蛋白奠定了基础。

地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进

Southern印迹杂交技术是检测特定DNA片段的常规方法之一,其操作程序繁琐,对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求,要获得理想杂交结果需要反复摸索。总结地高辛标记探针Southern印迹杂交的技术要点,并结合具体操作提出改良方案。

HPV16(新疆株)E6在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

目的 :利用酵母Pichiapastoris真核蛋白表在系统 ,表达HPV16 (新疆株 )E6 (HPV16XJE6 )蛋白。方法 :根据HPV16XJE6基因序列设计引物 ,并分别在 5′引物和 3′引物中引入了EcoRI和XbaI酶切位点 ,经PCR扩增后与pMD18-T载体相连 ,再将HPV16XJE6从T载体上切下并克隆至穿梭质粒pGAPZαA上 ,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA -E6经线性化后 ,采用LiCl法将重组穿梭质粒转入酵母细胞内 ,Zeocin+筛选鉴定 ,经小瓶发酵后 ,取上清作SDSPAGE检测。结果 :HPV16XJE6成功地在酵母真核表达系统获得表达 ,表达产物的分子量为 2 0kD ,为深入研究HPV16XJE6蛋白功能奠定了理论基础。

新疆荒漠昆虫光滑鳖甲cDNA文库的构建及功能基因筛选

以过冬后早春的新疆荒漠拟步甲属昆虫光滑鳖甲(Anatolica Polita borealis)成虫为研究材料,应用SMARTTM cDNA Library Construction技术,通过总RNA提取,反转录合成cDNA,定向构建至噬菌体载体λTripEx2,经体外包装构建了光滑鳖甲的cDNA表达文库。测试结果表明库容量为2.2×106,重组率为84.8%。通过对cDNA文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得28个光滑鳖甲表达序列标签(ESTs),包括17个EST(60.7%)与NCBI中已注册的已知功能基因相似性较高,另外的11个EST(39.3%)则没有发现与之相似的序列,推测可能是功能未知的新基因。同时,利用PCR扩增文库技术从cDNA文库中克隆获得了光滑鳖甲的抗冻蛋白基因,初步表明光滑鳖甲cDNA表达文库构建的成功,为深入研究新疆荒漠昆虫的抗冻机理及发现新的昆虫功能基因奠定了基础。

新疆妇女宫颈脱落细胞HPV16E6基因的PCR及荧光定量PCR检测

目的 了解新疆妇女人乳头瘤病毒 16型 (HPV 16)的感染状况。方法 用PCR及荧光定量PCR(FQ -PCR)方法检测妇科门诊普通患者宫颈脱落细胞及分泌物中人乳头瘤病毒 16型E6基因 (HPV16E6) ,以普通门诊患者宫颈脱落细胞及分泌物DNA作为样本 ,以人乳头瘤病毒 (HPV16E6)作为扩增的靶基因 ,同时以人 β -actin基因片段作为细胞内参照 ,借助于两对引物 ,两个特异的荧光探针 ,用荧光定量PCR(FQ -PCR)方法对这两个片段进行扩增 ,得到单位细胞HPV16E6的相对含量 ;同时进行定性PCR检测。结果 宫颈脱落细胞标本 15 9例中 ,β -actin阳性 15 4例 ;HPV 16E6阳性共 12例 ,阳性率为 7.8%。PCR与FQ -PCR结果基本一致 ,但FQ -PCR更敏感。结论 建立的FQ -PCR检测宫颈脱落细胞内HPV 16E6基因的方法 ,能反映单位细胞内病毒的复制情况 ,可用于性传播感染 (STI)