基因工程技术在1,3-丙二醇生产中的应用及研究进展

系统论述了基因工程技术在1,3-丙二醇生产菌株的代谢途径、调节子和关键酶改造中的研究进展,并对其应用前景进行了展望。

新疆出血热病毒基因组抗原表位及其实验室检测价值的评价

目的掌握克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)片段的精细抗原表位谱分布,明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热(CCHF)实验室检测中的价值。方法2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽,以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7(IgM)或CCHFV阳性羊血清为抗体,用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位(BCE),并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类,确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性,探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒(pET-32a、pGEX-KG)和带有不完整谷胱甘肽(GST188)标签的原核表达质粒(pXXGST-ST-1)构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位,建立间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法,以经免疫荧光法(IFA)鉴定的CCHF羊血清为对照,统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE,其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP_(2)(aa 170~305)有6个BCE,两端的NP1(aa 1~200)和NP3(aa 286~482)有9个BCE;GP片段的Gc(aa 1~558)和Gn(aa 533~708)片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽(AP),NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%,GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中,由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4(Ap)6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP(全长)、PGEX-KG-NP_(2)(aa 170~305)、pGEX-KG-NP_(2-1)(aa 235~275)、PGEX-KG-NP_(2-1-1)(aa 237~256)、pXXGST-1-NP_(2-1-2)(aa 250~265)和PGEX-KG-NP_(2-1-3)(aa 260~276)6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清(pAb)免疫印迹反应阳性,以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照,以NP_(2)和NP_(2-1)2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好,敏感度分别为73.4%(11/15)和66.7%(10/15),特异度分别为100%(18/18)和94.4%(17/18),总符合率分别为87.9%(29/33)和81.8%(27/33)。结论CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE,其中,优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

新疆短命植物抱茎独行菜种子粘液质特性的研究(英文)

以新疆荒漠植物抱茎独行菜为材料,运用光镜与扫描电镜观察以及紫外吸收光谱法、化学反应及种子萌发实验等方法,对粘液质的形态和结构,物理化学特性,粘液质对种子萌发及萌发后的影响进行了研究.结果显示：（1）完整干种子表面覆盖着一层膜状物质（完全脱水的粘液质）,并呈同一走向的山脊状突出的网状结构,遇水后粘液物质呈射线状向外发射出来,化学反应实验结果表明,粘液质的组成可能是某种多糖,如β-葡聚糖.（2）粘液质约占干种子重量的1/4,有很强的吸水能力,完全浸润10 min后,种子重量增加约30~40倍,种子长度、宽度、厚度的增加分别多于1倍、2倍、4倍;完全润湿的种子能够粘附相当于其干种子重量68倍的沙粒.（3）种皮粘液质对于不同土壤基质中的种子萌发有重要作用,但是对萌发后幼苗的生长没有作用.

新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物调节小鼠DCs成熟对Th_(1)/Th_(2)的免疫增强作用

旨在探讨新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物(ethanol extracts of wild Cistanche deserticola,EEWCD)调节Th1/Th2免疫反应的特点及初步的作用机制。采用卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)为抗原,研究EEWCD对小鼠体液免疫,细胞免疫,细胞因子分泌,树突状细胞(dendritic cells,DCs)的成熟和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)等的影响。EEWCD低、中、高剂量(分别记作L、M、H)分别与OVA混合,ICR小鼠随机分为0.9%NaCl、EEWCD、OVA、OVA-EEWCD-L、OVA-EEWCD-M、OVA-EEWCD-H和OVA-铝佐剂免疫组。皮下免疫2次,间隔2周。小鼠免疫后,ELISA法检测抗体滴度及分型,MTT检测脾细胞增殖水平,FACS检测CD4^(+)IL-4、CD4^(+)IFN-γ和CD8^(+)IFN-γ的水平,以及DCs表面分子与Treg表达水平。结果显示,EEWCD提高了OVA特异性IgG抗体2~3倍;在初次免疫后21 d显著促进IgG_(1)和IgG_(2a)的表达水平(P<0.05);显著促进OVA特异性脾细胞增殖以及T/B细胞的活化(P<0.05);显著促进CD4^(+)IL-4、CD4^(+)IFN-γ和CD8^(+)IFN-γ的分泌(P<0.05)。同时,EEWCD也显著促进了DCs的CD40、CD80、CD86和MHCII的表达(P<0.05),下调了Treg的水平(P<0.05)。EEWCD-M为最佳剂量。监测免疫后小鼠行为及体重,小鼠行为没有异常,且同一时间点各组体重之间差异不显著(P>0.05)。综上表明,EEWCD能够促进OVA特异性的Th_(1)/Th_(2)免疫反应,尤其促进Th_(1)型反应,具有良好的免疫调节活性,其作用机制可能为通过激活DCs的成熟,促进IL-4和IFN-γ的分泌,降低Treg的水平调节Th_(1)/Th_(2)免疫反应的动态平衡。

新疆短命植物东方旱麦草和独行菜C4相关结构的初步研究

短命植物的快速生长及高光效特性使它们能在早春萌发后较短时间内完成生活史并获得大量种子。为探讨高光效产生的内在原因,研究利用树脂半超薄与超薄切片技术对东方旱麦草和独行菜叶片显微及超微结构进行观察,并对维管束相关参数进行了统计分析,结果显示:(1)东方旱麦草显微结构具有类"花环"结构,维管束密度介于C3、C4对照之间,鞘细胞中的叶绿体多数离心分布且数量接近C4植物;超微结构显示其鞘细胞叶绿体的基粒与片层结构与叶肉细胞不同,但又与C4植物存在一定差异。(2)独行菜维管束有类"花环"结构,维管束密度大于C3对照并存在极显著差异,鞘细胞中叶绿体多数离心分布;超微结构显示叶绿体基粒与片层没有叶肉细胞发达。以上研究结果初步说明东方旱麦草和独行菜的解剖结构特点均介于C3、C4植物之间而接近C4植物。

新疆野生一枝蒿粗多糖对流感疫苗小鼠免疫增强效果的分析

用新疆野生一枝蒿粗多糖(wild Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,WARCP)通过肌肉注射免疫小鼠,研究其作为流感病毒疫苗(influenza virus vaccine,IVV)的佐剂效果和节约流感疫苗抗原用量的作用。WARCP与不同剂量(0.05、0.1、0.5μg)的IVV配伍,肌肉注射免疫小鼠,观察小鼠的生长状态,通过ELISA法检测血清中抗体IgG及IgG1、IgG2a的水平;MTT法检测脾淋巴细胞的增殖;流式细胞术检测细胞因子CD4^+ IL-4和CD8^+ IFN-γ以及CD4^+CD25^+Foxp3^+Treg细胞的表达水平。结果表明WARCP对小鼠的生长状态没有显著的影响(P>0.05);WARCP能够显著提高不同剂量IVV特异性IgG及其IgG_1、IgG_(2a)的抗体水平(P<0.05);增强淋巴细胞的增殖(P<0.05);显著提高IL-4和IFN-γ的分泌水平(P<0.05);降低Treg细胞的表达水平(P<0.05);尤其可以提高低剂量IVV的体液和细胞免疫反应,至少减少抗原用量91%。因此,WARCP作为IVV的佐剂通过降低Treg细胞的水平,显著增强了IVV的免疫效果,尤其是Th1型的免疫反应,能够很好地节约抗原用量,具有良好的安全性。

新疆家蚕抗菌肽在番茄汁加工中的应用研究

本文研究了新疆家蚕抗菌肽的耐热性及其对部分微生物的最小抑菌浓度,和其在不同pH值条件下的溶解度及抑菌效果。并在此基础上进行正交试验,得到将其应用于番茄汁加工中的最佳工艺条件,抗菌肽的添加可降低番茄汁的杀菌强度,提高产品品质,为工业化生产应用提供科学依据。

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S。构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NPHis融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(M r)。用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性。结果双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其M r约为66 000。ELISA检测抗体效价高于1∶25 600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白。结论成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体。

拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)在不同组织及非生物胁迫下的表达研究

【目的】研究拟南芥β-1,3-葡聚糖酶基因(BG1)在不同组织及胁迫条件下的表达规律。【方法】研究以拟南芥为材料,以28SrRNA为内参,利用半定量RT-PCR法研究了低温(4℃)、高温(37℃)、NaCl胁迫(200 mmol/L)和与之等渗的PEG(21.5%)干旱胁迫处理在不同组织(叶、薹、花、果)中BG1的表达情况。【结果】(1)正常植株中,BG1在不同组织的表达量不同:花、果>叶>薹。(2)胁迫处理对BG1的表达量有影响。在叶中,盐胁迫不影响其表达,其他处理都使其表达量减少;在薹中,除低温处理使其表达量明显增加,其他情况的表达都减少,37℃和干旱胁迫后几乎不表达;在花中,NaCl胁迫处理后表达量明显增加,PEG处理及高温胁迫后表达量下降;在果实中,BG1在PEG胁迫后表达量稍有增加,而37℃和盐胁迫表达稍有下降。【结论】在正常植株中,BG1的表达具有差异性;BG1对各种胁迫处理的响应不同。

新疆栽培一枝蒿粗多糖对OVA抗体水平及T淋巴细胞亚群的影响

初步探讨新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖(Un-deproteinization of cultivated Artemisia rupestris L.crude polysaccharides,UCARCP)对模式抗原卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)免疫小鼠后抗体水平以及T淋巴细胞亚群的影响。将UCARCP配伍OVA皮下免疫小鼠,初免1次,加强1次,铝佐剂为阳性对照组,间接ELISA法检测小鼠血清中IgG及亚类IgG_1、IgG_(2a)的抗体水平;流式细胞术检测脾细胞中CD3^+CD4^+和CD3^+CD8^+T淋巴细胞亚群的含量。结果显示,UCARCP能显著提高小鼠血清中Ig G、IgG_1、IgG_(2a)的抗体水平(P<0.05),且与铝佐剂组相比无显著性差异(P>0.05);UCARCP能显著促进CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞亚群的含量(P<0.05),与铝佐剂组相比没有显著差异(P>0.05)。新疆栽培一枝蒿未除蛋白的粗多糖能显著促进模式抗原OVA免疫后小鼠的体液免疫水平和细胞免疫水平,与铝佐剂相当。

异子蓬异型种子萌发基因差显的cDNA-AFLP技术体系优化

以异子蓬种子为材料,建立并优化其萌发过程中基因表达差显的cDNA-AFLP技术体系。分别以总RNA和mRNA反转录的双链cDNA为模板,对25μL PCR扩增体系中的退火温度、引物量、DNA聚合酶种类及电泳条件进行优化。结果显示,以分离的mRNA为模板可以反转录得到品质较好的双链cDNA;PCR扩增选择较高退火温度(第1轮为56℃,第2轮为65～56℃)、引物量为1μL(10μmol/L)、使用高效PremixLA Taq Hot Start DNA聚合酶、在约800V电压下进行60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,可得到条带清晰、多态性好的cDNA-AFLP结果。

新疆株HPV-16 L1在真核细胞中表达水平的初探

以密码子优化的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)主要衣壳蛋白基因L1作为对照研究新疆株HPV-16L1在真核细胞中的表达水平。将新疆株HPV-16L1与密码子优化的HPV-16L1分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1;重组质粒通过水动力转染技术注入小鼠体内或采用脂质体法转染293T细胞,RT-PCR检测HPV-16L1在小鼠肝脏及293T细胞中的转录;Western印迹检测HPV-16L1在293T细胞中表达的蛋白质。结果显示新疆株及密码子优化的HPV-16L1在小鼠肝脏及293T细胞中均发生转录,但新疆株L1的表达水平显著低于密码子优化L1的表达水平。

新疆荒漠肉苁蓉粗多糖对口蹄疫疫苗抗体和T细胞亚群的影响

为了筛选口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)疫苗的新型多糖佐剂,选用新疆荒漠肉苁蓉粗多糖与口蹄疫灭活抗原(inactivated foot-and-mouth disease viral antigen,FMDV-Ag)制备成水佐剂疫苗,ISA-206油佐剂疫苗和无佐剂疫苗,通过肌肉途径免疫ICR小鼠,检测免疫后血清抗体水平、淋巴细胞增殖反应、CD3^(+)CD4^(+)、CD3^(+)CD8^(+)和CD4^(+)CD44^(+)、CD8^(+)CD44^(+)T细胞亚群的表达水平等评价疫苗的免疫增强效果,并且监测小鼠免疫后的行为和体重变化观察安全性。肉苁蓉粗多糖可以显著提高FMDV特异性的抗体水平(P<0.05);同时显著增强了FMDV特异性的淋巴细胞增殖水平(P<0.05),显著促进了CD4^(+)、CD8^(+)和CD44^(+)T细胞比例(P<0.05)。免疫后小鼠没有观察到异常行为,且对小鼠体重增长没有影响。肉苁蓉粗多糖作为FMDV-Ag的水佐剂通过增强体液和细胞免疫水平发挥良好的免疫促进作用。

新疆乌苏天山山地南坡草原革蜱中立克次体感染调查及遗传进化分析

了解新疆乌苏地区草原革蜱中立克次体的感染情况.采集新疆乌苏天山山地南坡的草原革蜱,通过PCR对蜱中斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、埃立克体、伯氏疏螺旋体、查菲埃立克体、无形体、嗜吞噬细胞无形体、牛巴贝斯虫、巴贝西原虫、利什曼原虫、恙虫立克次氏体等11种病原体进行DNA分子检测,对检出的阳性样本进行测序,并与GenBank (NCBI)中的相应基因序列进行比对分析.106只草原革蜱中斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、埃立克体检测结果为阳性,阳性率分别为57.23%(99/173)、37.50%(30/80)和37.74%(20/53),其余8种病原体检测结果均为阴性;对斑点热群立克次体进行序列分析,建立分子系统进化树,结果显示Guertu-Dn1801 OmpA与吉林两株M198 (MF511260.1)和M30 (MF511254.1)同源性最高,一致性均为96.90%,属劳氏立克次体;Guertu-Dn1803OmpA与俄罗斯Gorno-Altaisk-2014-H-2株(KT006594.1)和苏联246株(U43807.1)同源性最高,一致性均为94.40%,属西伯利亚立克次体;而Guertu-Dn1801 gltA和Guertu-Dn1809 gltA分别与黑龙江3LB01 (KM245567.1)和内蒙古MD0202 (KP742992.1)序列一致性均为100%,属劳氏立克次体.乌苏地区可能存在斑点热群立克次体、贝氏柯克斯体、埃立克体3种病原体的流行,且斑点热群立克次体感染率较高,应加强对当地蜱类和蜱传疾病的监测和防控.

新疆一枝蒿醇提物未除多糖与除多糖对DCs成熟的影响差异

比较新疆一枝蒿未除多糖醇提物(Ethanol extract of wild Artemisia rupestris L.,EEWAR)和除多糖醇提物(Ethanol extract of wild Artemisia rupestris L removing polysaccharides,DEEWAR)的免疫调节活性.利用体外树突状细胞(Dendritic cells,DCs)为平台,FACS(Fluorescence Activating Cell Sorter)技术检测未除多糖EEWAR和除多糖EEWAR对DCs成熟的影响.超声法提取EEWAR,检测其多糖和黄酮含量.C57BL/6小鼠骨髓细胞进行体外培养,第7 d后收获DCs,不同剂量未除多糖及除多糖的EEWAR分别刺激DCs细胞12 h后,LPS为阳性对照,检测DCs表面分子(CD11c,CD40,CD80,CD86和MHCII)表达情况.未除多糖和除多糖的EEWAR多糖含量分别为30.1%,5.3%,黄酮含量分别为5.6%,16.4%.FACS实验结果显示,未除多糖及除多糖的EEWAR均能够剂量依赖性促进CD80,CD86和MHCII分子的表达水平,且除多糖后促进DCs成熟的能力增强了约一倍;未除多糖及除多糖的EEWAR对CD40分子的促进作用不明显.结果表明,EEWAR除多糖后免疫调节活性明显增强.

双峰驼凝乳酶原基因的生物信息学分析

通过生物信息学的方法对双峰驼凝乳酶原基因及相应的氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构域、亲水性/疏水性、二级结构进行预测分析。结果表明,双峰驼凝乳酶原基因开放阅读框全长1 146 bp,编码381个氨基酸,属于胃蛋白酶A超家族,预测定位于内质网(膜)的稳定亲水性蛋白,具有一个16个氨基酸的信号肽,其不含跨膜结构域。无规卷曲是其二级结构中最大量的结构元件,α螺旋和延抻链分散于整个蛋白质中,活性位点的分析表明,编码蛋白有6类活性位点。分析双峰驼凝乳酶原基因及其编码蛋白质的特征,能够为深入开展双峰驼凝乳酶的表达和凝乳特性研究提供理论依据。

新疆野生荒漠肉苁蓉粗多糖对口蹄疫疫苗免疫小鼠的佐剂效应

探讨新疆野生荒漠肉苁蓉粗多糖(wild Cistanche deserticola Y.C.Ma crude polysaccharides,WCDCP)对口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)疫苗免疫小鼠的佐剂效应及安全性。用不同剂量的WCDCP分别配伍FMDV灭活抗原及FMD疫苗,皮下注射ICR小鼠,免疫两次。ELISA法检测血清中IgG、IgG1及IgG2a抗体水平;流式细胞术检测淋巴结中CD4+CD44+和CD8+CD44+T细胞表达情况。结果表明,中、高2个剂量的WCDCP均能显著增强FMDV灭活抗原特异性IgG的抗体水平(P<0.01);中剂量的WCDCP显著增强了FMD疫苗特异性IgG及其IgG1、IgG2a抗体水平(P<0.05),而且具有长效性;WCDCP中剂量可以显著提高淋巴结中CD4+CD44+和CD8+CD44+T细胞的表达水平(P<0.05);WCDCP对小鼠的生长没有影响。总之,WCDCP可以长期增强FMD疫苗特异性抗体水平,显著增强T细胞免疫反应,对小鼠的生长无副作用。因此,WCDCP可以作为FMD疫苗的一种安全候选佐剂。

新疆地区虫媒病毒调查研究状况

近年来新疆陆续发现的一些新的虫媒病毒与虫媒病毒病对当地人畜健康造成一定危害。新疆地理生态环境的复杂多样性为多种虫媒病毒的传播提供了有利条件,虫媒病毒在新疆分布广泛,存在地域差异性。随着分子流行病学的发展,基于核酸分子和细胞培养检测技术方法从新疆的多种昆虫媒介和宿主动物中鉴定并分离得到分属于黄病毒科、披膜病毒科、呼肠孤病毒科和布尼亚病毒科的多种病毒,部分病毒属在新疆系首次发现。本文对新疆多个地区近年来已报道的虫媒病毒在宿主中的检测和感染人畜引起的疾病的情况进行了汇总整理,有利于对新疆各地虫媒病毒的流行病学进行深入的调查与研究。

盐胁迫下盐穗木甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达与亚细胞定位分析

为研究盐胁迫下植物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的作用机制,该研究利用RACE技术,从藜科盐生植物盐穗木中克隆获得1 381bp GAPDH基因(HcGAPDH)全长cDNA序列,其开放阅读框(ORF)编码314氨基酸。序列分析表明,HcGAPDH属于胞质GAPDH家族成员。实时定量PCR结果显示,HcGAPDH的转录水平受盐胁迫和ABA上调。通过荧光共聚焦显微技术,检测到绿色荧光蛋白标记的HcGAPDH在正常情况下定位于细胞质中,盐胁迫可促使其从细胞质转移至细胞核中,此过程与细胞内碳水化合物代谢的信号途径不具有相关性。研究表明,HcGAPDH通过细胞质和细胞核之间的信号传导在植物盐胁迫中发挥一定作用,为进一步揭示盐穗木耐盐分子机制奠定了一定基础。

粘液繁殖体种子的粘液质形成、分泌及释放相关基因

种皮粘液质是在种皮外层细胞的高尔基体内产生并分泌到胞腔内或细胞壁层的一种果胶类多糖物质.当干燥种子遇水后,粘液质即刻被释放形成透明胶质并完全包被整个种子.粘液质对种子的扩散定居、种子萌发以及幼苗的存活和生长均具有重要作用.粘液质作为一种模型研究细胞壁的产生及其形成的分子机制已经成为植物种皮发育与环境变化相适应关系的研究热点.本文主要对以拟南芥为代表的粘液质细胞和调控粘液质形成及释放相关基因的研究进展进行了综述,并对今后的研究方向进行了展望,以期为促进具粘液繁殖体植物的理论与应用研究,以及西部荒漠区的植物物种多样性保护提供科学依据.