AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ基因对非生物胁迫的应答研究

小分子热激蛋白是植物受到热胁迫后的主要表达产物之一,与植物细胞耐热有密切关系。该研究发现,拟南芥小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ和AtsHsp17.6-CⅡ除热激之外,重金属离子Ni+、Pb2+、Cu2+、Zn2+和Al3+均能诱导这2个热激蛋白基因的表达;氧化胁迫和渗透胁迫同样也能诱导它们表达。该研究将由CaMV35S启动子驱动的这2个小分子热激蛋白基因导入拟南芥,RT-PCR分析表明,2个小分子热激蛋白基因在转基因植物中呈现组成型表达。实验结果表明,组成型表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6-CⅠ的转基因植物表现出对6μmol.L-1Cd2+胁迫、0.4%NaCl胁迫的耐受性。研究表明,这2个小分子热激蛋白基因可能参与着多种抗逆途径,推测其能够减轻或抵抗逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复。

新疆雪莲研究进展

新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et kir.ex Maxim)为新疆特有珍稀名贵药材,具有很高的药用价值.本文概述了新疆雪莲的形态分布、化学成分、药理作用、细胞及组织培养和分子生物学等方面研究进展,并对新疆雪莲今后的研究发展方向进行了展望,为相关研究工作提供必要的参考,最终为实现对新疆雪莲的资源保护和合理开发利用服务.

新疆雪莲DFR基因的分离及同源遗传转化

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是植物重要的次生代谢产物花青素生物合成途径中的关键酶。运用RT-PCR和RACE技术从新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)中克隆得到DFR基因(GenBank登录号为JN092126)。DFR基因的cDNA全长序列含有1个1 029 bp的开放阅读框(ORF),编码343个氨基酸,该基因推断的蛋白与水母雪莲DFR基因推断的蛋白高度同源,相似性达到92%;以不同物种中DFR氨基酸序列进行比对分析,推断的蛋白含有与NADPH特异结合的结构域。将该基因运用农杆菌介导的叶片转化法进行同源转化,将含有转DFR基因的愈伤组织进行悬浮培养,紫外分光光度法测定愈伤组织的总黄酮含量,结果表明转基因愈伤组织的总黄酮含量明显高于非转基因愈伤组织的含量。该研究为提高新疆雪莲药用化学成分黄酮类物质及实现新疆雪莲花青素的人工生物合成的研究奠定基础,对解决天山雪莲资源匮乏提供参考。

转1Dx5基因小麦突变株系的研究

以转1Dx5基因小麦3个高分子量麦谷蛋白突变株系B73-6-1-1、B73-6-1-2和B73-6-1-3及转基因受体L88-6为材料,对其主要农艺性状、低分子量麦谷蛋白表达情况及染色体核型进行研究.结果表明:在田间栽培条件下,纯合稳定转基因突变株系之间及其与转基因受体之间主要农艺性状存在差异,其中株高和千粒重存在显著差异(P=0.05);同时,SDS-PAGE结果显示,在小麦低分子量麦谷蛋白区域,突变株系之间无明显差异,而突变株系与转基因受体之间部分区域表达量存在明显差异并产生一个突变条带;通过核型分析比较,得出突变株系之间及其与转基因受体之间,染色体无论是相对长度还是臂比值都没有显著差异.

新疆阿魏菇高效原生质体分离与再生体系的建立

以新疆阿魏菇为材料,研究了阿魏菇原生质体分离、再生体系建立的影响因素,建立了稳定的新疆阿魏菇原生质体分离、再生体系,并通过出菇验证了该体系的可利用性。结果显示,在35℃、0.6mol/LKCl稳渗剂条件下,菌龄为8d阿魏菇菌丝体(0.1g)在0.8mL酶解液中(1.5%离析酶+0.5%纤维素酶+2%溶菌酶)制备原生质体,酶解3h获得原生质体达5×106个/mL;在0.8mol/L蔗糖稳渗剂下,原生质体再生时间为16d,其再生率可达0.6%。出菇试验表明,获得的原生质体具有较强的恢复能力,能够与对照组在同样条件下正常出菇。从细胞水平上探索一条食用菌育种新途径,为发展和完善食用菌新菌株选育提供理论依据和技术借鉴。

阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立

以新疆阿魏菇为材料,研究菌龄、酶解时间、酶解液对阿魏菇菌丝原生质体产量的影响,同时还研究了不同渗透压稳定剂对原生质体再生的影响。结果显示,在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下,菌龄为8 d阿魏菇菌丝体(0.1 g)在0.8 mL混合酶解液中(1.5%离析酶+0.5%纤维素酶+2%溶菌酶)制备原生质体,35℃酶解3 h获得原生质体达5×106个/mL。原生质体再生结果显示,在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下,原生质体再生时间为16 d,其再生率可达0.6%。该文通过对阿魏菇原生质体分离和再生条件的研究,旨在从细胞水平上探索一条食用菌育种新途径,为发展和完善食用菌新菌株选育提供理论依据和技术借鉴。

甜瓜cDNA-AFLP分析体系的建立

选用新疆甜瓜伽师和皇后为试材,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适合于甜瓜的cDNA-AFLP反应体系。结果表明:适用于甜瓜cDNA-AFLP分析的RNA可以用Trizol试剂提取的总RNA,双链cDNA合成应用置换法,双链酶切用VspⅠ、TaqⅠ和EcoRⅠ、MseⅠ,效果均能达到目标。相比较而言,VspⅠ、TaqⅠ酶切组合更为理想。酶切cDNA用量、连接产物、预扩增产物稀释倍数参照常规AFLP技术中的常用即可满足要求。检测采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色,操作较文献介绍的变性胶方法简单、方便。实验得到了较为理想的甜瓜mRNA指纹图谱,建立的反应体系可以应用于甜瓜差异基因表达分析等方面的研究。

基因枪法获得无选择标记的1Dx5基因表达的转基因小麦

利用基因枪将无选择标记的优质高分子量麦谷蛋白亚基基因1Dx5导入新疆耐盐小麦品种新冬26,为利用优质基因进行小麦品质改良奠定基础。构建无选择标记的线性1Dx5表达框。利用基因枪将其转入不含该亚基的小麦品种新冬26幼胚盾片中,经PCR二分法筛选,从转化的1 000块幼胚盾片中共获得3株转基因阳性植株,转化效率0.3%。利用SDS-PAGE分析目的基因在转基因后代籽粒中的表达。转基因植株后代种子分析表明,1Dx5在转基因后代部分种子中表达。本研究成功地将无选择标记的线性1Dx5片段导入普通小麦新冬26中,并在后代部分种子中得到了表达。为利用优质亚基基因改良小麦加工品质奠定基础。

不同激素对小麦盾片再生能力的影响

选用10种含不同浓度2,4-D、Dicamba及2,4-D与Dicamba组合的诱导培养基和3种含0.01mg.L-1 2,4-D和不同浓度ZT的分化培养基,研究Dicamba、2,4-D、ZT对愈伤组织诱导和分化的影响。结果表明:2,4-D与Dicamba组合的诱导激素在再生分化上显著优于2,4-D和Dicamba。以添加1.5mg.L-1 2,4-D和0.5mg.L-1Dicamba为诱导培养基,分化培养基添加1mg.L-1 ZT和0.01mg.L-1 2,4-D对愈伤组织分化效果为最佳,绿苗分化率最高可达90%。分化培养基中1mg.L-1 ZT有利于根的分化。该研究结果为建立高效、稳定的新疆主栽小麦品种的遗传转化系统奠定了基础。

新冬26小麦幼胚盾片再生体系的建立

以新冬26小麦的幼胚盾片为实验材料,研究不同激素及其不同浓度对愈伤组织诱导和分化的影响。结果表明:2,4-D和Dicamba组合诱导的愈伤组织分化率显著优于单独添加2,4-D或Dicamba。分化培养基中添加低浓度的ZT有利于根的分化。诱导培养基采用MS附加2,4-D 1.5 mg/L和Dicamba 0.5 mg/L,分化培养基采用R附加ZT 1 mg/L和2,4-D 0.01 mg/L对愈伤组织分化效果为最佳,绿苗分化率最高可达90%。本研究结果为建立高效、稳定的新疆主栽小麦品种的遗传转化系统奠定了基础。

转基因小麦T_1代中外源基因的检测和分析

该研究采用Multiplex PCR和SDS-PAGE技术对转1 Dx5基因(ORF)T1代小麦进行了检测和分析.结果显示,Multiplex PCR能够扩增出转基因T1代材料中1 Dx2基因和1 Dx5基因的特征片段,表明外源基因已整合到受体基因组中;SDS-PAGE检测到一新的蛋白质亚基X,表明外源基因的插入引起了转基因T1代籽粒中HMW-GS组成的变化.该研究不仅验证了线性基因片段遗传转化策略的可行性,而且印证了普通小麦Glu-1D等位基因的多重PCR分子标记体系的有效性,为培育安全型的转基因作物新种质打下坚实的基础,加快小麦分子育种进程.

转基因小麦麦谷蛋白亚基突变体类型

采用十二烷基磺酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了含外源1Dx5和1Ax1的T7代转基因小麦HMW-GS的突变类型及等位变异.结果显示,随机挑选的1000份B72-8-11bT6代籽粒在T7代中共21类突变类型,其外源1Dx5基因表达频率为49.4%,GluA1、GluB1和GluD1共3、13和9个等位变异类型,分别以N、17+18和N为主,占94.7%、61.5%和49.7%;B102-1-2共11类,外源1Ax1基因表达频率占95%,GluA1、GluB1和GluD1共2、7和3个等位变异类型,分别以1、17+18和N为主,占95%、98.7%和98.3%。研究结果进一步说明了转基因株系的纯合性,完全符合孟德尔遗传分离规律,对小麦优质新品种的培育具有理论意义和应用价值.

转基因小麦插入突变蛋白的鉴定

为研究转基因小麦中插入突变蛋白的编码基因,以转基因小麦B73-6-1和受体小麦L88-6为材料,利用改良方法分离、纯化、回收目的蛋白后进行鉴定。N端测序结果显示,该蛋白N端前五个氨基酸序列(EGEAS)以及部分氨基酸序列与几乎所有高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)具有100%的同源性;同时,质谱鉴定结果显示,该蛋白的两个得分最高(96和58)的肽段(GGSFYPGETTPPQQLQQR和IFWGI-PALLKR)与1Dx5亚基的同源性达到100%,初步证明该突变蛋白为新的HMW-GS。这对外源1Dx5基因整合位点的确定和外源基因整合规律的研究提供了更多依据。

小麦染色体标本制备方法的优化

制备出分裂相多、杂质少、背景清晰、染色体分散且形态好的染色体标本,一直是细胞遗传学实验课关注的重点和难点.本文在去壁低渗火焰干燥法的基础上,改良了小麦染色体制片方法,分析了影响染色体标本制备效果的主要因素.

天山雪莲UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及功能分析

UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(Flavonoid-3-O-glucosyltransferas,3GT)是植物重要的次生代谢产物生物合成途径中的关键酶。文中采用现代生物信息手段,经3GT的同源比对后设计基因特异引物,运用RT-PCR及RACE技术从天山雪莲Saussurea involucrata Kar.et Kir.叶片中克隆得到3GT基因的全长序列(GenBank Accession No.JN092127)。3GT基因的cDNA全长序列含有1个1 548 bp的开放阅读框(ORF),编码516个氨基酸,该基因推断的蛋白与草莓GT6蛋白的相似性为91%,与毛杨梅3GT的相似性为89%;经序氨基酸序列比对,推断的天山雪莲3GT具有糖基转移酶基因家族特有的结构域PSPG-box。半定量PCR的结果显示,天山雪莲3GT基因在叶及愈伤组织中表达量最高,在根中有少量表达,茎中不表达。将该基因构建到含有35S启动子的植物表达载体上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行同源转化,将筛选到的含有转3GT基因的愈伤组织进行悬浮培养,并用紫外分光光度法测量其黄酮含量是非转基因愈伤组织总黄酮平均值的2.06倍。

一种检测转1Dx5基因小麦植株的新方法

目的:建立一种有效区分Glu-1D等位基因的Multiplex-PCR体系,快速检测转1Dx5小麦植株。方法:根据1Dx5和1Dx2亚基基因的区别设计特异的PCR引物,通过多重PCR技术检测花粉管通道法转化1Dx5核心片段的转基因T1代植株。结果:Multiplex-PCR能够在转基因T1代材料中扩增Glu-1D等位基因的特征条带,分别为343bp、320bp的1Dx5基因特异片段以及361bp的1Dx2基因特异片段,与预期结果一致。结论:该技术能够检测多个靶基因,有效地区分转基因Glu-1D上的等位基因,证实外源1Dx5基因已整合到受体基因组中,对检测基因组庞大、外源基因序列GC含量高且与内源基因同源性高的转基因小麦十分有效。

阿魏菇耐高温转化子测定和同工酶分析

经过电击新疆阿魏菇(Pleurotus ferulae Lanzi)原生质体转化平菇(Pleurotus ostreatus)总DNA获得3株转化子,在高温生长条件下对转化子及其母本、父本测定菌丝长度,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶分析。研究结果表明:转化子生长速度远大于母本而趋向于父本。电泳共获得6种过氧化物酶谱带,21种酯酶谱带。根据酶谱分析得知3株转化子酶带数与母本相似,但部分酶带亮度大于母本,与父本较为相似,与菌丝结果一致。酯酶酶谱聚类分析结果与传统分类学结果一致。