新疆南疆规模羊场片形吸虫的基因鉴定及分析

片形吸虫是严重影响新疆养羊业发展的主要寄生虫病之一。本研究从新疆南疆某规模化羊场感染片形吸虫分离获得3株虫体并提取总DNA,以片形吸虫ITS-1、ITS-2基因设计2对特异性引物,PCR扩增、电泳,获得预期目的片段约360 bp、250 bp。测序结果经核苷酸同源性比较、系统发育树分析,来自新疆南疆样品与肝片吸虫参考株ITS-1、ITS-2基因序列核苷酸同源性达100%、99.7%,证实新疆南疆某规模化羊场感染的片形吸虫为肝片形吸虫。

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

1例疑似溶血性曼氏杆菌感染的诊断及生物信息学分析

试验旨在研究溶血性曼氏杆菌的生物学特性,以新疆阿克苏市某羊场疑似感染溶血性曼氏杆菌的绵羊为研究对象,对其感染情况和发病症状进行调查记录;解剖病死羊,无菌采集组织脏器,通过普通PCR法对病料进行实验室病原学诊断,同时对溶血性曼氏杆菌基因及其蛋白特性进行生物信息学分析。结果显示,病死羊肺脏充血、出血、实变,肠道出血、淋巴结肿大;巴氏杆菌PCR、16S rRNA检测结果均为阳性,该病例最终诊断为溶血性曼氏杆菌感染。生物信息学分析结果显示,该蛋白为亲水性蛋白,具有54个磷酸化位点,二级结构为其结构连接5个α-螺旋。研究表明,该羊场羊感染溶血性曼氏杆菌。

山羊痘病毒036(gtpv-036)基因的克隆及序列分析

为研究山羊痘病毒036(gtpv-036)基因的生物学特征,试验利用PCR法扩增gtpv-036基因,经NdeΙ、XhoΙ双酶切后与PET 42b同源重组构建其原核表达载体,并用菌液PCR和测序鉴定,测序结果进行生物信息学分析,预测其蛋白生物学特性。结果表明:成功构建原核表达载体PET 42b-gtpv-036,测序结果显示036基因大小为285 bp,与山羊痘gtpvIsolateIndia等参考株系同源性为97.9%~100%,遗传进化树表明其与gtpv处于同一分支,亲源关系最近,测序比对发现其基因有2个碱基发生了突变,推测氨基酸序列:从第37位和95位异亮氨酸密码子是“ATA”分别突变成异亮氨酸氨酸“ATT”和天冬氨酸氨酸“CTA”;预测山羊痘病036蛋白亚细胞定位在细胞质;蛋白信号肽的剪切位点位于第23和24号氨基酸之间;蛋白磷酸化位点有10个;蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其次β-折叠,三级结构以α-螺旋为主,推测山羊痘病gtpv-036蛋白功能可能是巯基氧化酶。这为制备山羊痘病毒疫苗研究和为研发新型药物提供理论基础。

山羊痘病毒晚转录因子VLTF-1的原核表达及生物信息分析

试验旨在研究山羊痘病毒晚转录因子VLTF-1的特性。研究以山羊痘病毒SS基因组株为模板,采用PCR方法扩增晚转录因子VLTF-1基因,采用基因克隆常规方法与pET-42b表达载体相连接构建原核表达载体,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定,阳性克隆转化大肠杆菌BL21,以0.1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳和Western Blot检测表达情况;同时对VLTF-1基因及其蛋白特性进行生物信息学分析。结果显示,PCR扩增的目的基因全长783 bp,与参考株Pellor同源性为100%,推测其编码261个氨基酸。遗传进化树分析表明,羊痘病毒属的3个种各分成一个分支,目的基因与山羊痘毒株位于同一分支。测序结果显示,目的基因表达载体构建正确,SDS-PAGE检测表达了27 kDa的蛋白,Western Blot鉴定表明目的蛋白得到表达。生物信息学分析结果显示,SS株的VLTF-1基因与山羊痘病毒聚于一支,该蛋白是一个跨膜亲水蛋白,具有26个磷酸化位点,二级结构是其结构连接5个α-螺旋。研究表明,试验成功克隆晚转录因子VLTF-1基因,并诱导表达蛋白,预测该蛋白的生物学信息。

大肠杆菌ESBLs基因克隆表达载体的构建与鉴定

大肠杆菌是一种最常见的革兰氏阴性菌,是一种常见的条件性致病菌。由于在治疗大肠杆菌时抗生素的大量使用,使大肠杆菌产生了很多耐药基因,其中超广谱β-内酰胺酶对许多β-内酰胺类抗生素具有耐药性,且以其中的CTX-M型为主,为了更好地研究产超广谱β-内酰胺酶,本次实验通过设计并扩增产超广谱β-内酰胺酶的CTX-M-3基因,并通过Nde I、Xho I两种限制性内切酶酶切并连接,预计构建pET-42b-ESBLs的原核表达载体,并送往上海生工公司进行测序,并对测序结果的遗传相似性及遗传进化进行分析,由于引物的特异性或模板的特殊性,测序结果显示扩增结果为DH5α染色体基因组并构建的载体是DH5α染色体基因的原核表达载体。

山羊痘病毒晚转录因子VLTF-3基因的原核表达及结构预测

研究旨在了解羊痘病毒晚转录因子VLTF-3结构特征和生物学特征。试验采用PCR方法扩增羊痘病毒Thx毒株晚转录因子VLTF-3基因,将其插入质粒PET-42b中建立原核表达载体,经菌液PCR和测序方法鉴定。阳性质粒转入大肠杆菌BL21中,用0.1 mmoL/L的IPTG诱导其表达蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot技术进行蛋白的表达的检测与鉴别。基因检测结果利用DNAMAN、DNAStar和Mega等软件进行生物信息学分析和建立遗传进化树,对其编码的氨基酸序列在线进行二级结构分析和高级结构的预测,并对其信号肽、跨膜特性、亲水性、磷酸化位点和抗原性等生物学特性进行分析。结果显示:试验成功扩增了VLTF-3的基因组,并建立了原核表达载体pET-42b-VLTF-3。测序结果表明,GTPV-VLTF-3基因全长681 bp;与参照株GTPV-Pellor毒株的同源性达99%,保守性较强,编码227aa,与理论相符。遗传进化树分析结果显示,该基因与皮肤疙瘩病遗传距离最近。SDS-PAGE检测结果显示,该蛋白质大量表现在上清中;Western blot结果显示,该蛋白与His标签进行了融合表达。VLTF-3蛋白不具有信号肽,为非分泌型蛋白,共有22个磷酸化位点,α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角分别占34.80%、35.68%、22.91%、6.61%,三级结构以α螺旋为主。研究表明,试验成功克隆了晚转录因子VLTF-3,并能够可溶性表达其蛋白,生物分析预测其高级结构α螺旋为主。

绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S rpsE基因的原核表达及多克隆抗体的制备

旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等;采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到30S rpsE基因片段,经NdeⅠ、XhoⅠ酶切纯化后,将其连接到pET-42b载体上,构建原核表达载体pET-42b-30S rpsE,使用不同浓度IPTG诱导蛋白在大肠杆菌BL21中表达;重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用镍层析法纯化蛋白后,与弗氏佐剂1∶1混合注射免疫家兔,然后采取全血,检测血清抗体效价及特异性。结果:经预测30S rpsE蛋白是亲水无信号肽的膜外蛋白,无跨膜结构域,有一个糖基化位点;成功构建了原核表达载体pET-42b-30S rpsE,表达的重组蛋白分子量约为25.9 ku,以包涵体和可溶性的形式存在;免疫家兔后血清抗体效价为1∶25 600,证实30S rpsE蛋白具有较好的免疫原性。

山羊Notch1基因的表达及细胞定位

为了进一步了解Notch1蛋白,本研究用BLAST方法对不同动物Notch1基因的同源性及遗传进化情况进行了分析,通过PCR扩增获得Notch1基因,并构建了与GST标签融合表达的原核表达载体、与GFP标签融合表达的真核表达载体。将双酶切和测序鉴定的阳性克隆分别转化BL21感受态细胞和转染BHK21细胞进行原核和真核表达,并用Western blot和荧光显微镜鉴定。同时,与GFP标签对照确定其在细胞中的定位情况。结果显示,扩增的Notch1基因片段约780 bp,为Notch1基因的部分序列,Notch1在不同动物间的基因序列同源性为94%以上,遗传进化关系上分为3个分支。Western blot检测结果显示,构建的原核表达pGEX-KG-Notch1能够表达预期大小为56 kDa的融合蛋白;荧光显微镜检测显示Notch1与GFP的融合蛋白分布在整个细胞中,但主要集中于细胞核,而GFP空白对照仅分布于细胞质中,说明Notch1主要定位于细胞核中。本研究为进一步探索Notch1与KLP1的相互作用及其功能奠定了基础。