鼠反义转化生长因子βⅠ型受体真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建鼠反义转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)基因pcDNA3.1(+)真核表达质粒,为进一步研究通过TβRⅠ干预肝纤维化的发生发展提供实验基础.方法:将取冰冻保存的大鼠肝组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度.使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因TβRⅠcDNA片段,采用巢式PCR扩增TβRⅠ基因片断.用CaCl2法诱导感受态细胞.将真核表达载体pcDNA3.1(+)在多克隆位点处用EcoRⅠ、XholⅠ双酶切线性化,切胶纯化回收;TβRⅠ基因片断双酶切后切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(+)线性化载体和TβRⅠ基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(+)为载体的反义TβRⅠ基因真核表达质粒.转化JM109大肠杆菌.酶切证实的阳性克隆行测序分析.结果:琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好;并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9150,认为RNA纯度良好;RNA浓度为770mg/L.阳性克隆质粒经双酶切后行10g/L琼脂糖凝胶电泳在DNAMarker430bp和线性化纯化后pcDNA3.1(+),5.3kb附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功.DNA测序结果与预期目的片段序列一致.结论:鼠反义TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核表达重组质粒构建成功.