基于荧光硅球的克伦特罗快速定量免疫层析试纸条的研制

采用荧光硅球为标记物制备了快速定量检测克伦特罗（CLE）的荧光硅球免疫层析试纸条。通过正交实验得到最优荧光硅球抗体标记量、硅球垫抗体标记物用量以及检测线抗原浓度。在最优条件下，试纸条线性范围为0．28-3.3μg／L。猪尿样品CLE加标回收率为81．7％～101％，表明此试纸条可实现猪尿中CLE残留的快速定量检测。

免疫磁珠富集结合酶联免疫吸附法检测酱油中黄曲霉毒素B_1

将活泼酯法活化后的羧基化超顺磁珠与辛酸一硫酸铵法纯化的抗黄曲霉毒素B，单克隆抗体偶联，获得黄曲霉毒素B，（AFB。）免疫磁珠。比较不同粒径大小的免疫磁珠的富集效率，优化磁珠偶联抗体的条件以及富集AFB。的反应条件，初步建立了以免疫磁珠富集结合酶联免疫吸附法检测酱油基质中的AFB，的方法。结果表明：酶联免疫吸附法在0．05～0．3gg／kg范围内具有良好的线性关系，相关系数为0．9842。在酱油中添加加1-7μg／kgAFB，的平均加标回收率为83．6％～104％，相对标准偏差为7．2％～13．7％。该方法具有快速简便、设备简单、灵敏度高、准确性好等优点，可很好地应用于酱油中的AFB，的快速检测。

大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条的研制

目的:建立快速、灵敏检测大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条法。方法:以羧基化荧光微球作为标记物,共价偶联抗大肠杆菌O157:H7鼠源单克隆抗体,将大肠杆菌O157:H7兔多抗和驴抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,以双抗体夹心反应模式制备大肠杆菌O157:H7荧光微球免疫层析试纸条。结果:通过优化实验确定偶联缓冲液为0.02mol/L pH5.0磷酸盐缓冲液,抗体偶联微球量为100μg/mg,试纸条可在加样5min后判读结果。制备的荧光微球试纸条对纯培养大肠杆菌O157:H7进行检测,肉眼观察检测限在1.2×104CFU/mL,借助荧光读取仪检测限能提高到6.1×103CFU/mL。试纸条除与金黄色葡萄球菌有微弱交叉反应外,与实验室保存的30株细菌无交叉反应。结论:大肠杆菌O157:H7荧光微球试纸条具有操作简便、快速灵敏、易于量化的特点,为该菌的检测提供了一种新型的手段。

流式细胞术在食源致病菌检测中应用的研究进展

流式细胞术是能够用来快速检测液相中悬浮粒子多种物理特性的一种现代分析方法。因其具有分析速度快和灵敏度高等优点,该方法正逐渐被应用于食源致病菌的检测。本文介绍了流式细胞术的两个主要应用平台(流式细胞仪和Luminex系统)的工作原理和分析流程,并着重对近年来将流式细胞术用在食源致病菌检测中的相关研究进行了调研和综述,从食源致病菌全菌分析以及细菌核酸检测等方面进行了剖析,对该方法在食源致病菌检测中应用的前景作了展望。

大豆粉末磷脂同时制备甘油磷脂酰胆碱和甘油磷脂酰乙醇胺的研究

以大豆粉末磷脂为原料,研究了甲醇钠催化其醇解反应,同时制备含有甘油磷脂酰胆碱(GPC)和甘油磷脂酰乙醇胺(GPE)的混合物。通过探讨大豆粉末磷脂与无水甲醇料液比、催化剂甲醇钠添加量、反应温度、反应时间对反应产物中GPC和GPE得率的影响规律,确定了甲醇钠催化醇解大豆粉末磷脂的最佳反应条件:料液比1∶4,催化剂甲醇钠添加量5%(以大豆粉末磷脂质量计),反应温度35℃,反应时间6 h。在最佳反应条件下,GPC得率为93.60%,GPE得率为88.69%。

孔雀石绿单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

通过合成羧基化孔雀石绿,采用活泼酯法制备孔雀石绿免疫抗原CMG-BSA、检测抗原CMG-OVA。采用CMG-BSA免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选和克隆化获得了一株稳定的抗孔雀石绿单克隆抗体,并建立了检测孔雀石绿的直接竞争ELISA方法。ELISA方法的最佳操作参数:孔雀石绿抗体稀释倍数1:16000(1mg/ml),酶标抗原(CMG-HRP)使用质量浓度0.2μg/ml。该方法具有良好的灵敏度和特异性,IC50值0.3ng/ml,最低检测灵敏度达到0.05ng/ml,标准曲线方程为y=-20.888x+81.423(R2=0.9813)。

磺酸化磁珠富集鱼塘水中的孔雀石绿

采用1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺及N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化磁珠表面羧基,将对氨基苯磺酸偶联在磁珠表面,获得磺酸化磁珠。以此磺酸化磁珠为吸附剂,建立了分散固相萃取富集鱼塘水中孔雀石绿的新方法,并对水体样本的最佳吸附pH值及解吸附条件进行了考察。结果表明:当水体样本pH值在3.0～6.0之间,磺酸化磁珠对水体中孔雀石绿有较好的吸附,在pH=4.0时,孔雀石绿的吸附效率达到最高,为82.4%±5.5%;乙腈可有效洗脱吸附在磺酸化磁珠表面的孔雀石绿。在25℃,pH 4.0时,磺酸化磁珠吸附孔雀石绿的等温吸附符合Langmuir模型。磁珠的最大吸附容量为66.7μg/g,Langmuir吸附平衡常数为0.375 L/μg。

饮用水中硫化物的表面增强拉曼光谱检测方法

基于表面增强拉曼光谱(SERS)技术,建立了一种对饮用水中硫化物快速筛查的方法。以自制纳米/胶体金为表面增强基底,并利用紫外可见吸收光谱法和透射电镜(TEM)对该基底进行表征。待检样本经简单前处理,其中所含性质活泼的硫化物能与N,N二乙基对苯二胺(DPD)反应生成亚甲基蓝类化合物,该化合物经衍生后,在低功率(100 mW)和短积分时间(500 ms)条件下直接测试其拉曼光谱,并通过与硫化物衍生物的标准拉曼图谱比对进行定性分析。硫化物衍生物的SERS化学信号大约在453 cm-1和458 cm-1两处,分别对应于亚甲基蓝化合物中C—N—C的不同振动模式。本方法能够准确筛查饮用水中硫化物,整个测试过程少于10 min,检测限为0.02 mg/L,能够满足国家标准的限量要求。该方法简单、快速,结果准确,可以作为一种高灵敏的快速筛查手段。

孔雀石绿胶体金检测样品前处理工艺的优化

为建立快速筛选孔雀石绿的前处理方法,对标行标水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法(KJ201701),用于水产品中药物残留的现场快速检测使用。试验采用提取、氧化、浓缩和复溶四个步骤,对氮吹、SPE柱、反萃取三种不同提取方式进行前处理优化和比较,通过胶体金免疫层析试纸条进行检测。结果表明:三种方法均能达到同时检测水产品中孔雀石绿的目的,检测时间为反向萃取法<SPE柱法<氮吹法。说明反向萃取法具有用时短、不需要复杂仪器、检测结果准确率高的特点,更适合用于基层快速检测。

羊驼免疫库的制备及抗孔雀石绿纳米抗体的筛选

孔雀石绿(malachite green,MG)是一种易溶于水和乙醇等的基础染料,可在多种行业应用,并曾用于水生动物多种疾病如真菌病、寄生虫病、细菌性疾病等的治疗。但因其具有致癌等毒副作用,目前已被禁用。然而市场上仍有在水产品违法使用MG的现象,因此需要加强对该药品残留的检测。本研究选择羊驼免疫库筛选抗MG纳米抗体,通过噬菌体ELISA筛选高亲和力和特异性的纳米抗体。通过辅助噬菌体M13的救援,使得纳米抗体基因(VHH)与噬菌体外壳蛋白基因融合表达,从而使得VHH蛋白展示在噬菌体表面,通过有限稀释筛选和多次洗脱的办法,获得含有目的基因的单个噬菌克隆;将重组质粒PMES4-VHH转化到表达细胞中,进行体外表达。最后采用NI-NTA柱进行His标签纯化,得到抗MG纳米抗体,并进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果显示:噬菌体文库成功构建,库容为3.2×108 cfu/mL;通过ELISA筛选,得到16个具有抑制效果的噬菌体克隆,经对噬菌体基因测序并翻译,得到2种氨基酸序列;将重组质粒转化至表达菌株表达、纯化,最后得到大小约为15 kDa的抗MG纳米抗体,从而为MG的下一步检测奠定了基础。

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定

以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法成功筛选获得2株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11。抗体效价为1∶160 000以及1∶20 000,亚型为IgG1、IgG2a,Dot-ELISA结果表明4A7和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性,Western blot分析表明4A7、4H11抗体分别与单核细胞增生李斯特菌62 kDa以及32 kDa外膜蛋白抗原表位结合,胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原。