黑曲霉β-葡聚糖酶基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达及重组酶性质

以黑曲霉(Aspergillus niger)高耐热葡聚糖酶编码基因eglA6在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中的表达及重组酶性质为研究目的。利用乳酸克鲁维酵母表达系统,构建表达eglA6基因的重组菌K.Lactis GG799/pKLAC1-eglA6 SL105,重组菌摇瓶发酵酶活达到23.0 U/mL。重组酶AnEglA6K表观相对分子质量为5.6×10^(4),明显高于同一基因在巴斯德毕赤酵母中的表达产物。重组酶最适pH为5.0,最适温度为75℃,在80℃时酶活半衰期为65.0 min。以微晶纤维素为底物时重组酶比酶活约为0.5 U/mg。基因eglA6在乳酸克鲁维酵母中的表达产物与其在巴斯德毕赤酵母中的表达产物有明显差异,前者相对分子质量明显高于后者,热稳定性和结晶纤维素降解活性也高于后者。以乳酸克鲁维酵母为宿主表达eglA6基因获得的重组葡聚糖酶具有很高的耐热性,适合在饲料工业中应用。

一种中性普鲁兰酶及其在红薯粉丝制作中的应用

本研究旨在开发一种在较宽泛的pH范围内活性稳定的中性普鲁兰酶,以适应以红薯面为原料的粉丝制作工艺。以地表地芽孢杆菌(Geobacillussubterraneus) XQ3665基因组DNA为模板,经PCR扩增得到普鲁兰酶基因pul3665,并实现了异源表达。重组酶PUL3665纯酶比酶活为32 U/mg,最适反应温度55℃,最适pH为6.5,在pH 5.5~7.5范围内酶活保持在最高酶活的80%以上。PUL3665降解普鲁兰多糖的产物为麦芽三糖,不降解可溶性直链淀粉,是一种I型普鲁兰酶。在以不同pH值的红薯面为原料的粉丝制作工艺中,按每克芡糊淀粉2 U的量添加枯草芽孢杆菌表达的PUL3665粗酶液处理芡糊,均能在不添加明矾或其它添加剂的条件下制作出粉丝,且成品粉丝质量与添加明矾获得的粉丝基本一致。PUL3665有希望开发成一种用量小,使用效果稳定的新型明矾替代物。

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外。重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积累在大肠杆菌胞质内的产物有明显的差异,分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的重组酶BsBsP的比酶活为153.7 U/mg,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶BsBsP最适pH为6.0,最适温度为45℃。重组酶BsBsP对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶。在以土豆淀粉为原料的粉丝制作工艺中,以重组酶BsBsP水解芡糊淀粉可以有效降低粉丝断条率。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶可利用自身结构实现高效分泌表达,重组酶适用于以淀粉为原料的粉丝制作。

一种中性普鲁兰酶的高效表达及重组酶在粉丝制作中的应用

为获得适合粉丝制作工艺的普鲁兰酶,研究了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)普鲁兰酶基因GsP在不同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌中的表达及重组酶的应用效果。分别以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢杆菌1A717和蛋白酶基因缺失的菌株WB600为宿主菌,构建了表达GsP的重组菌,酶活检测和SDS-PAGE分析表明,两种重组菌产生的普鲁兰酶均为胞外酶,分别命名为GsP1a和GsPwb。两种重组酶分别用于粉丝制作,以GsP1a处理的芡糊制作的粉丝成品断条率接近于0,由GsPwb处理的芡糊制作的粉丝断条率高于前者,这可能与宿主菌WB600在发酵过程中产生的α-淀粉酶有关。该研究表明,中性普鲁兰酶是粉丝制作中明矾的理想替代物,酶液中α-淀粉酶活性的去除有利于其应用性能的提升。

一种高耐热普鲁兰酶的克隆表达、酶学性质及其在粉丝制作中的应用

为了获得一种适合在粉丝制作中使用的高耐热普鲁兰酶,对Thermus thermophilus的普鲁兰酶基因进行了异源表达及应用性质研究。以T.thermophilus XQ5331基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增获得普鲁兰酶编码基因TtP5331,在大肠杆菌中实现高效表达。重组酶TtP通过离子交换层析获得初步纯化。酶学性质研究结果显示,重组酶最适作用温度为75℃,最适pH6.5,在最适条件下比酶活为17 U/mg。重组酶TtP在90℃下保温10 min仍能保留约60%的酶活,沸水浴5 min可以完全灭活。在传统粉丝制作工艺基础上,采用先加酶后制芡糊的方式制作粉丝,按照每克芡糊淀粉1 U的量添加TtP处理芡糊,制作的粉丝的断条率为4.5%,与添加明矾获得的粉丝基本一致。以上结果说明,在酶法粉丝制作工艺中,TtP适合在芡糊制作前在淀粉悬液中添加,是一种用量小、使用简便的明矾替代物。