目的:制备过敏原Der p 23重组蛋白并建立其特异性IgE化学发光免疫检测方法。方法:以屋尘螨Total RNA为模板,依据GenBank公布的序列(No.EU414751)设计并合成引物,RT-PCR扩增Der p 23编码基因,构建原核表达质粒pET28a(+)-Der p 23,转化大...目的:制备过敏原Der p 23重组蛋白并建立其特异性IgE化学发光免疫检测方法。方法:以屋尘螨Total RNA为模板,依据GenBank公布的序列(No.EU414751)设计并合成引物,RT-PCR扩增Der p 23编码基因,构建原核表达质粒pET28a(+)-Der p 23,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,柱层析纯化收集目的蛋白并采用SDS-PAGE、Western blot鉴定。以此重组蛋白包被化学发光板,建立化学发光免疫分析法检测经ImmunoCAP检测的过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘患者血清。结果:纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定可见单一条带,定量分析呈现0.5 ml、0.25 mg/ml、纯度>95%的重组蛋白纯化成功。以该重组蛋白建立化学发光方法检测屋尘螨过敏性哮喘或/和过敏性鼻炎患者血清,阳性率为89.8%,以国际金标准ImmunoCAP方法同步检测Der p 23单组分特异IgE阳性率为95.92%,两种方法检测结果差异无统计学意义(χ^2=0.237,P=0.626)。结论:获得了屋尘螨过敏原重组蛋白Der p 23,成功建立了其化学发光免疫检测方法,为过敏原单组分分辨诊断方法建立提供了技术平台。展开更多
目的建立用于腐食酪螨过敏原特异性IgE抗体检测的纳米磁微粒化学发光法。方法依据化学发光常规操作步骤,设置条件建立腐食酪螨过敏原特异性IgE检测的化学发光反应体系和合适的免疫反应条件,并以美国Phadia方法为标准,评估所建立化学发...目的建立用于腐食酪螨过敏原特异性IgE抗体检测的纳米磁微粒化学发光法。方法依据化学发光常规操作步骤,设置条件建立腐食酪螨过敏原特异性IgE检测的化学发光反应体系和合适的免疫反应条件,并以美国Phadia方法为标准,评估所建立化学发光方法的检验性能。应用SPSS21.0软件对两种方法的阳性率x2进行检验,以Pha出a为标准,评价化学发光方法的检测性能。结果化学发光反应体系中,发光底物A液中鲁米诺浓度为0.4mg/ml、发光底物B液中过氧化氢脲浓度为0.2mg/ml,此发光反应体系对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的敏感性很髙,可检测到H RP的最小量为0.01mg/m l,在免疫反应中,加人底物A液和B液后室温避光反应5min检测,在5〜30 min内检测数值均有效,37 t:为最佳发光反应温度;选择0.35~H X H U/m l范围作为标准曲线;以Phadia方法为标准,本研究建立的化学发光法敏感度为80.95%、特异度为100%、漏诊率为19%,用于检査腐食酪螨有显著意义。结论本研究成功建立纳米磁微粒化学发光法检测腐食酪蜗过敏原特异性IgE抗体。展开更多
目的克隆、表达腐食酪螨主要过敏原Tyr p 35的cDNA,检测其表达产物与血清IgE结合活性。方法根据Tyr p 35基因序列(GenBank Accession No.KX060612)设计引物,PCR扩增cDNA,构建原核表达载体pET-28a(+)-Try p 35,转化至E.coli BL21(DE3)ply...目的克隆、表达腐食酪螨主要过敏原Tyr p 35的cDNA,检测其表达产物与血清IgE结合活性。方法根据Tyr p 35基因序列(GenBank Accession No.KX060612)设计引物,PCR扩增cDNA,构建原核表达载体pET-28a(+)-Try p 35,转化至E.coli BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,层析法纯化重组蛋白,Western blot法检测其与血清IgE的结合率。结果克隆Tyr p 35基因全长为1 461bp,编码486个氨基酸,为稳定的亲水性蛋白,含有醛/组氨醇脱氢酶活性位点。将测序正确的表达质粒pET28a(+)-Tyr p 35转化Competent cell BL21(DE3)T1R,经IPTG诱导表达目的蛋白,部分可溶性表达。Western blot检测rTyr p 35血清IgE结合率为82.35%(14/17)。结论成功克隆rTyr p 35基因,其表达产物为主要过敏原之一,纯化后仍具有血清IgE结合活性,为腐食酪螨过敏原标准化,诊断试剂以及脱敏治疗制品的研发奠定了基础。展开更多
文摘目的:制备过敏原Der p 23重组蛋白并建立其特异性IgE化学发光免疫检测方法。方法:以屋尘螨Total RNA为模板,依据GenBank公布的序列(No.EU414751)设计并合成引物,RT-PCR扩增Der p 23编码基因,构建原核表达质粒pET28a(+)-Der p 23,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,柱层析纯化收集目的蛋白并采用SDS-PAGE、Western blot鉴定。以此重组蛋白包被化学发光板,建立化学发光免疫分析法检测经ImmunoCAP检测的过敏性鼻炎或/和过敏性哮喘患者血清。结果:纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定可见单一条带,定量分析呈现0.5 ml、0.25 mg/ml、纯度>95%的重组蛋白纯化成功。以该重组蛋白建立化学发光方法检测屋尘螨过敏性哮喘或/和过敏性鼻炎患者血清,阳性率为89.8%,以国际金标准ImmunoCAP方法同步检测Der p 23单组分特异IgE阳性率为95.92%,两种方法检测结果差异无统计学意义(χ^2=0.237,P=0.626)。结论:获得了屋尘螨过敏原重组蛋白Der p 23,成功建立了其化学发光免疫检测方法,为过敏原单组分分辨诊断方法建立提供了技术平台。
文摘目的建立用于腐食酪螨过敏原特异性IgE抗体检测的纳米磁微粒化学发光法。方法依据化学发光常规操作步骤,设置条件建立腐食酪螨过敏原特异性IgE检测的化学发光反应体系和合适的免疫反应条件,并以美国Phadia方法为标准,评估所建立化学发光方法的检验性能。应用SPSS21.0软件对两种方法的阳性率x2进行检验,以Pha出a为标准,评价化学发光方法的检测性能。结果化学发光反应体系中,发光底物A液中鲁米诺浓度为0.4mg/ml、发光底物B液中过氧化氢脲浓度为0.2mg/ml,此发光反应体系对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的敏感性很髙,可检测到H RP的最小量为0.01mg/m l,在免疫反应中,加人底物A液和B液后室温避光反应5min检测,在5〜30 min内检测数值均有效,37 t:为最佳发光反应温度;选择0.35~H X H U/m l范围作为标准曲线;以Phadia方法为标准,本研究建立的化学发光法敏感度为80.95%、特异度为100%、漏诊率为19%,用于检査腐食酪螨有显著意义。结论本研究成功建立纳米磁微粒化学发光法检测腐食酪蜗过敏原特异性IgE抗体。
文摘目的克隆、表达腐食酪螨主要过敏原Tyr p 35的cDNA,检测其表达产物与血清IgE结合活性。方法根据Tyr p 35基因序列(GenBank Accession No.KX060612)设计引物,PCR扩增cDNA,构建原核表达载体pET-28a(+)-Try p 35,转化至E.coli BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,层析法纯化重组蛋白,Western blot法检测其与血清IgE的结合率。结果克隆Tyr p 35基因全长为1 461bp,编码486个氨基酸,为稳定的亲水性蛋白,含有醛/组氨醇脱氢酶活性位点。将测序正确的表达质粒pET28a(+)-Tyr p 35转化Competent cell BL21(DE3)T1R,经IPTG诱导表达目的蛋白,部分可溶性表达。Western blot检测rTyr p 35血清IgE结合率为82.35%(14/17)。结论成功克隆rTyr p 35基因,其表达产物为主要过敏原之一,纯化后仍具有血清IgE结合活性,为腐食酪螨过敏原标准化,诊断试剂以及脱敏治疗制品的研发奠定了基础。
