携带bla_(KPC-2)基因泛耐药肺炎克雷伯菌可移动遗传元件分析

目的了解临床分离的携带bla_(KPC-2)型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌中可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)存在情况。方法在2008年11月至2009年7月从住院患者中分离19株携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌,通过分析3种基因gyrA、parC和mdfA序列对菌株进行分子鉴定。采用PCR方法检测4种可移动遗传元件遗传标记基因,分别为:泛宿主性接合性质粒遗传标记trbC、转座子Tn1548遗传标记tnpU、Ⅰ类整合子遗传标记qacE△1‐sul1和插入序列共同区遗传标记ISCR1基因;对扩增阳性的4种遗传标记基因PCR产物采用双向测序,测序结果用Chromas软件直接作BLAST Search比对分析。结果本组19株gyrA、parC和mdf A基因PCR扩增均阳性,其基因序列经Gen Bank中的BLASTn程序进行同源性比较分析,证实19株均为肺炎克雷伯菌。19株中,4种可移动遗传元件遗传标记trbC、tnpU、qacE△1‐sul1和ISCR1基因阳性率均为100.0%,经对该4种遗传标记基因PCR阳性产物进行测序比对,发现与Gen Bank中已发布的4种相对应基因trbC、tnpU、qacE△1‐sul1和ISCR1序列完全相同(同源性均为100.0%),均得到确认。结论可移动遗传元件在携带bla_(KPC-2)型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌中广泛存在。

生物信息学技术在细菌毒力基因研究中的前景及意义

海量的生物学数据必然蕴含着重要的生物学规律,这些规律是解释生命之迷的关键.人们需要一种强有力的工具对这些数据进行分析,故一门交叉融合学科应运而生——生物信息学（Bioinformatics）.生物信息学融合了生物学、数学、计算机与网络技术和信息学等学科,包含收集、组织与整理、储存、分析和解释分子生物学实验数据.这些实验数据可以是基因与基因组（含转录组）数据、蛋白质组数据,也可以是代谢组数据.数十年来,生物信息学专家推出了众多的工具软件和形形色色的数据库,为生命科学研究提供了强大的工具.

携带bla_(KPC-2)基因泛耐药肺炎克雷伯菌16S rRNA甲基化酶基因和氨基糖苷类修饰酶基因分析

目的 了解临床分离的携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌中16S rRNA甲基化酶基因和氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因的分布。方法 在2008年11月～2009年7月从笔者医院住院患者中分离19株携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌,采用PCR及序列分析的方法分析6种16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA）和14种AMEs基因[ant（3″）-Ⅰ、ant（2″）-Ⅰ、ant（4′）-Ⅰ a/b、aadA4/5、aadA6/16、aac（3）-Ⅰ、aac （3）-Ⅱ、aac（3）-Ⅲ、aac（3）-Ⅳ、aac（6′）-Ⅰb、aac（6′）-Ⅱ、aph（3′）-Ⅰ、aph（3′）-Ⅱb和aph（3＇）-Ⅵa].结果 19株中,5种基因aac（3）-Ⅱ、aac（6′）-Ⅰb、aac（6′）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ和aph（3′）-Ⅰ的阳性株数[阳性率（％）]分别为2（10.5％）、1（5.3％）、19（100.0％）、19（100.0％）和2（10.5％）,其余15种基因均阴性;AMEs基因总阳性率为100.0％ （19/19）.对1株（6号菌株）aac（6′）-Ⅰb基因PCR阳性产物进行测序,证实为aac（6＇）-Ⅰb-cr双功能酶基因.结论 氨基糖苷类修饰酶基因aac（6′）-Ⅱ和ant（3″）-Ⅰ在携带blaKPc-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌中广泛分布。

携带bla_(KPC-2)型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌对喹诺酮类耐药机制研究

目的了解临床分离的携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物的耐药机制,为临床治疗提供参考依据。方法在2008年11月-2009年7月从住院患者中分离19株携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析两种喹诺酮类药物作用靶位编码基因(gyrA、parC)和5种质粒介导的喹诺酮类耐药相关基因。结果 19株携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因PCR扩增均阳性,1株(5.3%)aac(6′)-Ⅰb-cr基因阳性,qnrA、qnrB、qnrS和qepA基因均阴性;序列分析结果表明,19株gyrA和parC基因均发生突变,分别导致gyrA基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)出现两个位点错义突变,导致第83位丝氨酸(Ser)被异亮氨酸(Ile)取代、第87位天冬氨酸(Asp)被甘氨酸(Gly)取代,parC基因QRDR出现1个位点错义突变,导致第80位丝氨酸被异亮氨酸取代。结论染色体介导的耐药机制仍是临床分离的携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌对喹诺酮类药物耐药主要机制。

金黄色葡萄球菌临床分离株功能基因及其二元分型研究

目的 研究一组金黄色葡萄球菌临床分离株毒力基因和耐药基因的存在状况.方法 连续收集浙江省宁波市第一医院2013年7至9月临床分离的金黄色葡萄球菌共40株,采用聚合酶链反应（PCR）的方法分析42种毒力基因和11种耐药基因,再以10类毒力基因和1种耐药基因mecA检测结果作二元分型.结果 40株金黄色葡萄球对青霉素的敏感率为12.5％ （5/40）,对红霉素的敏感率为42.5％（17/40）,对其余15种抗菌药物的敏感率均大于65.0％.除了人主要组织相容性复合体（M HC）类似蛋白编码基因map未检出,其他几类毒力基因：黏附素、细胞毒素、荚膜抗原、超抗原、丝氨酸蛋白酶均有检出,检出率为2.5％～100.0％.耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、红霉素类、四环素类、季铵盐消毒剂、抗菌肽的耐药基因均有检出,检出率为2.5％～37.5％.40株菌株经二元分型可分为16种阳性基因检出模式,每株菌最少检出3类毒力基因,最多检出7类毒力基因和1类耐药基因mecA.结论 本组菌株耐药表型和耐药基因型符合率较高,菌株携带多种毒力基因和耐药基因.

泛耐药鲍曼不动杆菌PBP1A、CarO及β-内酰胺酶的编码基因分析

目的了解一株泛耐药鲍曼不动杆菌（js01株）可能存在的β-内酰胺类药物耐药机制。方法对自2011年12月宁波市第一医院住院患者的痰样本js01株分离，用gyrA和parC基因PCR扩增、测序和BLASTn比对确认菌种。用PCR法分析33种β-内酰胺酶基因（13种A类酶基因、10种B类酶基因、2种C类酶基因、8种D类酶基因）和插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测以及CarO膜孔蛋白编码基因。再用分段PCR法扩增PBP1A编码基因，双向测序后拼接成全长序列。结果js01株检出β-内酰胺酶TEM-1、ADC-30、OXA-23和OXA-66编码基因。插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测显示ISabal-ADC-30和ISabal—OXA-23为阳性。js01株carO基因序列与鲍曼不动杆菌敏感株（SDF）相比存在有义突变，氨基酸序列一致率为76．0％（189／249），存在3个氨基酸缺失。is01株PBP1A编码基因序列与SDF株相比存在有义突变，氨基酸序列的一致率为99．6％（848／851），存在3个氨基酸变异，但js01株PBP1A蛋白分子立体结构比SDF株丢失2个螺旋结构。结论本株鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类药物耐药主要与该菌株管家基因（PBP1A、CarO编码基因）突变与可移动遗传元件介异的β-内酰胺酶编码基因有关。

肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位喹诺酮耐药决定区变异型与底物分子对接分析

目的了解2种肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位喹诺酮耐药决定区变异型与各种底物的结合能力。方法参照野生型作同源建模获得2种肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位变异型（I型和FH型）立体结构，ArgusLab4．1软件中的DOCK模块做DNA旋转酶A亚单位野生型和2种变异型与7种喹诺酮类药物分子对接，计算酶与底物结合自由能值（AG），并计算DNA旋转酶A亚单位氨基酸残基与环丙沙星相互作用原子对数量及距离。结果肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位变异型I型、FH型与吡哌酸、环丙沙星、加替沙星结合自由能值分别为-26．60750、-29．53039、-29．49309kJ／mol，-26．69644、-28．97283、-29．59050kJ／mol；野生型分别为-27．18882、-30．87200、-30．24404kJ／mol，即吡哌酸、环丙沙星、加替沙星与2种变异型结合力下降，呈现耐药。I型、FH型与左氧氟沙星结合自由能值为-29．01381、-29．49757kJ／tool，野生型为-28．01620kJ／mol。I型、FH型与萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星结合自由能值有升有降。DNA旋转酶A亚单位野生型、I型、FH型与环丙沙星相互作用形成原子对距离在5×10^-10m以内的分别有16对、2对和4对；形成原子对距离在4×10^-10m以内的只有8对，均为野生型。结论肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位2种变异型与环丙沙星结合力下降是耐药的形成因素。