不同基因载体系统对脐带血间充质干细胞转染效果的初步研究

目的比较慢病毒载体和腺病毒载体转染人脐带血间充质干细胞后,外源基因的表达。方法采用人脐带血分离培养间充质干细胞,制备表达GFP的慢病毒载体和腺病毒载体,用以转染间充质干细胞,观察其外源基因的表达。结果脐带血间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;转染5周后,慢病毒载体转染的GFP阳性表达明显高于腺病毒载体。结论慢病毒载体较腺病毒载体作为基因转导系统更有优势。

携带BMP-2基因的慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞定向分化

目的构建含有人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein 2,hBMP2)cDNA的重组慢病毒DNA,在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后,观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再反转录成cDNA,扩增出hBMP2 cDNA的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA。将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞,通过碱性磷酸酶(AP)、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况。结果①扩增出1.2 kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA(pHIV-hBMP2);③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析。④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后,碱性磷酸酶分泌增加,钙沉积增加,Ⅰ型胶原蛋白表达增加,成功向成骨细胞转化。结论重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化,为组织工程研究提供良好的种子细胞。

人类脐带血间充质干细胞的培养及鉴定

目的对人类脐带血中的有核细胞进行分离培养及鉴定,观察能否得到间充质干细胞。方法抽取人类脐带静脉血,进行细胞分离和培养,并进行荧光激活细胞分析。结果脐带血中间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;流式细胞术鉴定结果表明这种细胞能表达CD29、CD44、CD90、CD95、CD105、CD166以及MHCⅠ(组织相容性抗原复合体Ⅰ),但不能表达CD14、CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、CD117、CD152以及MHCⅡ(组织相容性抗原复合体Ⅱ);并且具有分化成骨细胞和脂肪细胞的潜能。结论可以从人类脐带血中成功分离培养得到间充质干细胞。

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞(rMSCs)的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因序列,设计带有NheI、AgeI双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90%和71%,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79%和0.05%。扩增出1.2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。