新型抗菌肽基因设计、合成及其在酵母中的表达(Ⅰ)——杂合抗菌肽基因的设计与合成

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码子设计了一种新型抗菌肽基因，基因合成采用二次ＰＣＲ（聚合酶链式扩增）方法．设计和合成的基因全长１４０个碱基对，包括氨基酸编码序列、起始密码子、终止密码子和两端限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ识别顺序，合成的基因克隆于ＰＣＲＴＭ２．１载体上．经ＤＮＡ序列分析证实，合成基因碱基序列与设计序列完全一致．

人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达

Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 是由Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ的Ｎ 端１１１ 位氨基酸残基和Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｄ 的Ｃ 端１２３７ 位氨基酸残基构成的一个杂合肽，抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 的氨基酸序列，以酵母偏爱密码设计了Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因，全长１４０ｂｐ 。采用基因片段化学合成结合ＰＣＲ 法合成Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因。合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因克隆到ｐＣＲＴＭ２１ 上，进行ＤＮＡ 序列测定，证实合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因的ＤＮＡ 序列与设计序列完全一致。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因定向克隆到大肠杆菌酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２ 的Ｂａｍ ＨＩ和Ｓａｌ Ⅰ位点上，构建成含Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因的重组质粒ｐＣＡＤ，将重组质粒转化入宿主酵母ＡＢ１０３ ，以大肠杆菌Ｋ１２Ｄ３１ 为指示菌，用活性蛋白酸性ＰＡＧＥ 法测定，具有抑菌活性，表明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因在酵母中获得表达。