乙脑病毒持续感染模型建立及初步应用研究

目的 :建立流行性乙型脑炎病毒持续感染模型 ,为抗病毒药物筛选提供实验模型体系。方法 :采用流行性乙型脑炎病毒标准株及人肝癌细胞株KN73 建立持续感染模型 ,应用标准胰蛋白酶消化技术进行细胞传代 ,经反复冻融方法收集细胞内病毒 ,采用BHK细胞空斑实验进行病毒滴定。选用Suramine进行病毒抑制实验。结果 :在早期 (感染后 2 4～ 36h)细胞培养液中病毒量为 10 6PFU/ml,在后期 (感染后 3年 )细胞培养液中病毒量为 10 3 ～10 4PFU/ml,细胞内病毒含量一直维持在 10 2 ～ 10 3 PFU/ml水平 ;在细胞传代后第 2d ,80 μg/ml的Suramine可使病毒量由 2 .3× 10 3 PFU/ml降至 2 .3× 10 2 PFU/ml。结论

流行性乙型脑炎病毒结构蛋白编码基因的重组构建

目的:建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)C、prME,E等结构蛋白编码基因克隆。方法:病毒感染C6/36细胞,RT-PCR法依次获取该病毒结构蛋白基因并进行DNA测序分析,PCR克隆法将PCR产物分别构建于真核表达载体pcDNA 3.1的BamH I与EcoR I酶切位点并依次命名为pJC、pJME与pJE,通过DNA测序、电泳以及限制性内切酶分析加以鉴定。结果:JEV C、prME与E基因片段分别为380、2 001以及1 500 bp,各基因测序结果与发表的JEV JaGAr-01株相对应序列相一致,从重组质粒释出的插入子分别与各基因大小相符合。结论:pJC、pJME与pJE重组质粒分别含有C、prME与E蛋白编码基因。

流行性乙型脑炎病毒NS4A蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌的表达

目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因。方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用AB I PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3 a的BamH I与EcoR I酶切位点并命名为pNS4A,电泳进行限制性内切酶分析。结果:JEV NS4A蛋白基因大小为446 bp,DNA测序与发表的JEV JaGAr-01株相对应的DNA序列相符合,酶切后从重组质粒释出的插入子与JEV NS4A蛋白基因大小相一致。pNS4A在原核细胞内表达的特异蛋白分子量约16 kDa,与JEV NS4A蛋白理论计算相一致。结论:获取的JEV NS4A蛋白基因来自于JaGAr-01野生株,pNS4A在大肠埃希菌中表达的蛋白产物为JEV NS4A蛋白。

乙脑病毒prME与E蛋白编码基因重组构建的DNA免疫试验研究

目的 研究乙脑病毒prME、E蛋白的体外表达特点 ,比较不同重组质粒所进行的DNA免疫效率。方法 分别将乙脑病毒 (JaGAr 0 1株 )prME、E蛋白编码基因 (2 0 0 1bp、15 0 0bp)构建于融合FLAG标记基因的真核表达载体pcDNA(FLAG) 3上 (pJME、pJE) ,脂质体法将二重组质粒转染于HepG2及COS 1细胞系 ;采用不同抗体系统 (anti FLAG、anti E) ,经Westernblot法检测乙脑病毒prME[相对分子质量 (Mr)约 72× 10 3]与E(Mr 约 5 4× 10 3)蛋白表达水平 ;将质粒肌注BALB c鼠 ,二次免疫后 3周 ,腹腔注射乙脑病毒 (10 5PFU 10 0 μl)作为病毒攻击并观察 2 1d。 80 %空斑减少中和实验法检测中和抗体滴度变化。结果 anti FLAG可检测到由质粒pJME、pJE编码的相应蛋白产物在转染细胞内表达 ,同时在pJME转染的细胞内检测到一个新的 11× 10 3的低Mr 蛋白。anti E仅在pJME转染的细胞内检测到E蛋白。肌注pJME可产生高水平中和抗体滴度以及诱导有效的保护性免疫 ,效果等同于普通灭活JE疫苗 ,但优于pJE。结论 pJME的体外表达水平优于pJE。DNA免疫实验结果与prME。

抗癌药物对人胰腺癌细胞小分子RNA155及B细胞整合簇表达的影响

目的了解抗癌药物对人胰腺癌细胞小分子RNA155（miR-155）及其前体B细胞整合簇（BIC）RNA表达的影响。方法人胰腺癌PANC-1细胞分别给予吉西他滨等抗癌药物处理后，实时定量RT-PCR测定BICRNA和成熟的miR-155表达变化情况。应用磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）相关激酶抑制剂渥曼青霉素了解P13K相关激酶是否与BICRNA的调节有关。结果经抗癌药物处理后，PANC-1细胞内BICRNA表达显著上调，1．0、2．5、5．0、10．0mg／L吉西他滨处理后48h BIC RNA的表达量分别是37．1±4．1、29．0±5．7、21．0±7．6、40．4±9．0，均高于对照组（1．6±1．1，均P〈0．05）；处理后72h BIC RNA表达分别为27．7±3．1、43．1±1．2、31．8±5．4、23．1±1．4，均明显高于对照组（1．0±0．1，均P〈0．05），10mg／L 5-氟尿嘧啶和100mg／L博来霉素处理后48h，BICRNA表达分别为5．2±1．1和11．5±0．7，均高于对照组（1．7±0．7，均P〈0．05）。各浓度吉西他滨处理后48h，PANC．1细胞内miR-155水平与对照组比差异无统计学意义（P〉0．05），但处理后72h，miR-155水平高于对照组（2．21±0．40、1．86±0．03、2．47±0．04、3．24±0．05比1．11±0．09，P〈0．05）。吉西他滨诱导的BICRNA上调可以被渥曼青霉素抑制，1μmol／L渥曼青霉素＋5mg／L吉西他滨组和10μmoL／L渥曼青霉素＋5mg／L吉西他滨组BICRNA表达均低于5mg／L吉西他滨组（5．34±1．11、1．26±0．07比11．82±3．11，均P〈0．05）。结论抗癌药物处理能明显诱导人胰腺癌PANC-1细胞BICRNA上调，并引起成熟miR-155上调，吉西他滨诱导的BICRNA上调与P13K信号通路相关。