肝素酶和氯化锂对抗肝素的RT-PCR抑制作用的试验条件优化

目的探讨肝素酶和氯化锂在对抗肝素抑制逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)作用的试验条件优化及它们各自的优缺点。方法从随机采集20份人临床肝素抗凝全血中提取总RNA并经电泳鉴定后,每份RNA分为未处理组、肝素酶Ⅰ在0.4U、0.5U即时,30min,60min几种条件下的处理组和氯化锂在-20℃下10min、60min,过夜几种条件下的处理组,再逆转录合成cDNA,分别行看家基因β-actin的PCR反应,经1%琼脂糖凝胶电泳观察和比较获得的目的片段。结果从肝素抗凝全血分别抽提的总RNA,经电泳鉴定完整性好,可以进行逆转录-聚合酶联反应。未经处理的RNA经看家基因β-actin的RT-PCR反应后,未能扩增到目的片段;在肝素酶Ⅰ处理组中,仅肝素酶Ⅰ0.5U,并作用60min条件下能扩增出β-actin片段;在氯化锂处理组中,三种时间段作用下,均能扩增出β-actin片段,并且过夜条件下扩增获得的目的片段的量最多;经优化的试验条件的肝素酶Ⅰ和氯化锂作用RNA后,扩增得到的β-actin片段的量基本一致。结论获得肝素酶Ⅰ和氯化锂处理肝素抑制RT-PCR的试验优化条件,并比较了各自的优缺点,为临床相关试验提供一定帮助。

室间隔缺损患者外周血细胞因子基因表达状况的研究

目的利用基因芯片技术,比较室间隔缺损病人和健康人外周血单个核细胞的细胞因子基因表达差异,从整体上认识室间隔缺损患者的细胞因子表达状况。方法通过检测102例室间隔缺损(VSD)患者外周血常规,并从中选择3例血小板平均体积不同数值的室间隔缺损的病人,另选5例健康人,应用总核糖核酸(RNA)的提取法(Trizol法)分别提取他们的外周血总RNA,逆转录合成cDNA,用Cy5、Cy3分别标记病人、健康人的cDNA,混合后在细因子基因谱芯片上杂交,经对原始数据的标准化和SAM芯片数据软件的应用,获得表达有显著性差异的细胞因子基因。结果在102例VSD患者中,73例血小板平均体积低于正常值,占71.57%,3例血小板平均体积不同数值的患者均表现为27种细胞因子基因表达下调,一种细胞因子基因表达上调。其中β胸腺素-4和核糖体蛋白S5基因在三个样本中均表达下调,我们对各自基因的作用进行分析,了解可能的分子机制。结论分析室间隔缺损病人外周血细胞因子的基因表达图谱,β胸腺素-4和核糖体蛋白S5基因可能在心室发育中共同起重要的作用。

肾上腺髓质素对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞MCP-1表达的影响

目的观察肾上腺髓质素（ADM）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响。方法体外培养大鼠主动脉VSMCs。实验分组：空白对照组（A组）；1×10^-7mol/L ADM组（B组）；1×10^-7mol／LAngⅡ组（C组）；1×10^-8mol／L ADM＋1×10^-7mol／L AngⅡ组（D组）；1×10^-7mol／LADM＋1×10^-7mol／LAng Ⅱ组（E组）。采用逆转录聚合酶链反应技术测定细胞中MCP-1 mRNA的表达量。结果C组MCP-1 mRNA的表达量高于A组（P〈0．05）。D组、E组MCP-1 mRNA的表达量低于C组（P〈0．05）。结论ADM对Ang Ⅱ诱导的大鼠主动脉VSMCs MCP-1的表达起明显的抑制作用，这可能是其发挥抗炎、心血管保护作用机理中的一个重要途径。

房间隔缺损患者外周血细胞因子基因表达的研究

目的利用基因芯片技术,比较房间隔缺损(ASD)患者和健康人外周血单个核细胞的细胞因子基因表达的差异,从整体上认识房间隔缺损患者的细胞因子表达状况。方法通过检测57例ASD外周血常规,并从中选择4例血小板平均体积不同数值的房间隔缺损的患者和5例健康人,应用Trizol法分别提取他们的外周血总RNA,逆转录合成cD-NA,用Cy5、Cy3分别标记患者、健康人的cDNA,混合后在细胞因子基因谱芯片上杂交,经对原始数据的标准化和SAM芯片数据软件的应用,获得表达有显著性差异的细胞因子基因。结果在57例ASD患者中,47例血小板平均体积低于正常值,占82.46%,4例血小板平均体积不同数值的患者均表现为细胞因子基因表达下调,并都显示组织相容性复合物Ⅰ(MHCⅠ)、β胸腺素-4和祖血小板碱性蛋白3种基因表达下调,我们对各自基因的作用进行分析,了解可能的分子机制。结论分析房间隔缺损外周血细胞因子的基因表达图谱,β胸腺素-4可能在心房发育中起重要作用;祖血小板碱性蛋白基因表达的下调与血小板平均体积相关,可能对患者的免疫状态起一定的作用。

肝素对逆转录抑制作用的研究

目的:研究肝素在逆转录过程中的作用。方法:提取人肺胚胎二倍体细胞和肝素抗凝血中总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量好后,逆转录合成相应的cDNA,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;用基因芯片技术检测cDNA。将肝素抗凝血中提取的总RNA分为等量的两部分,分别用肝素酶或氯化锂处理RNA进行逆转录为cDNA和RNA合成cDNA后再用肝素酶或氯化锂处理,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;并用基因芯片技术检测氯化锂处理RNA后cDNA。结果:二倍体细胞来源的RNA为模板,能扩增出β-actin产物,并且在基因芯片上有杂交点。肝素抗凝血来源的RNA,在肝素酶或氯化锂作用后行逆转录者,能扩增到β-actin的目的片段,且基因芯片上有杂交点;而在未处理者不能扩增到目的片段,且基因芯片上无杂交点。结论:肝素是一种逆转录的抑制剂,对RNA逆转录cDNA过程有较强的抑制作用。