日本乙型脑炎病毒GⅢ型标准品质粒的构建

目的构建检测日本乙型脑炎病毒(JEV)GⅢ型拷贝数的质粒标准品,利用该质粒标准品定量检测病毒的拷贝数。方法通过设计引物经反转录聚合酶链反应扩增JEV相对保守区序列(prM结构蛋白),得到的目的片段克隆连接到pMD19-T载体上,从而获得JEV质粒标准品。随后,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)得到质粒标准品的标准曲线方程以及对JEV患者血清中病毒拷贝数进行检测。结果构建的JEV质粒标准品的RT-qPCR结果显示:相同浓度复孔间Ct值差异小(<0.5),熔解曲线峰值单一。得到的标准曲线方程为y=-0.2889 x+11.516,R 2=0.993,乙脑患者血清样品原液及倍比稀释度的病毒拷贝数分别为1184130.27、120912.86、10736.84、1053.45、121.25 copies/μL。结论本研究成功构建了检测JEV的质粒标准品,通过RT-qPCR发现其具有稳定性好、灵敏度高等优点,可应用于JEV拷贝数的定量检测。