长链非编码RNA核富集转录体1调节不均一核糖核蛋白A2蛋白对人肝细胞癌进展的研究

目的 通过RNA免疫共沉淀寻找长链非编码RNA（lncRNA）核富集转录体1（NEAT1）相关的RNA结合蛋白,验证这些RNA结合蛋白参与NEAT1调节肝癌相关基因核内不均一核糖核蛋白A2（hnRNPA2）表达的分子机制,观察NEAT1调节hnRNP A2的表达对人肝细胞癌的进展的影响.方法 查询Starbase 2.0数据,寻找与NEAT1相互作用密切的RNA结合蛋白,通过RNA免疫共沉淀明确能同时与NEAT1和NEAT1所调控基因mRNA相互作用的RNA结合蛋白,RNA pull-down明确RNA结合蛋白与NEAT1作用靶点片段,使用转染试剂Lipofectamine 2000和siRNA NEAT1（终质量浓度100 nmol/L）敲低HepG2细胞NEAT1表达,Western blot、免疫组织化学检测NEAT1对hnRNP A2蛋白的调节,使用逆转录病毒STP-重组逆转录病毒载体作为载体建立hnRNP A2过表达模型并应用于NEAT1低表达的HepG2细胞模型中,细胞计数试剂盒（CCK-8）增殖实验（10 μl/2 000个细胞）和Transwell小室研究NEAT1低表达的HepG2细胞（2×10^5个/孔）过表达hnRNP A2后与对照组的增殖、侵袭功能.HepG2经NEAT1敲低后2×10^6/0.2 ml腋下注射建立裸鼠皮下成瘤模型,与对照组（si-NC）比较肿瘤体积,hnRNP A2表达.结果 U2AF65能够与NEAT1和hnRNP A2 mRNA相互作用（富集度分别为IgG的82.659倍和53.527倍）,NEAT1敲低降低了hnRNP A2 mRNA转录和蛋白表达（P＜0.01）,这种调控作用可能与NEAT1-U2AF65复合物相关,hnRNPA2过表达可以促进NEAT1敲低的HepG2细胞增殖和侵袭功能（P＜0.01）.结论 NEAT1通过调节hnRNP A2蛋白影响了肝细胞癌细胞的增殖和侵袭能力.

长链非编码RNA核富集转录体1促进人肝癌细胞增殖和侵袭的研究

目的 在人肝细胞癌（HCC）标本中检测癌和癌旁组织中长链非编码RNA（lncRNA）核富集转录体1（NEAT1）的表达差异,应用化学合成小干扰RNA （siRNA）抑制两组人肝癌细胞株（HepG2和SMMC-7721）NEAT1的转录,观察NEAT1转录降低后对HCC细胞的表达谱、侵袭和增殖功能的影响.方法 利用Trizol-氯仿提取HCC组织标本和癌旁组织（n=12）,细胞株（HepG2、SMMC-772、HCC-LM3）中的总RNA,实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组NEAT1表达差异[甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参],使用转染试剂Lipofectamine 2000和siRNANEAT1（终质量浓度100nmol/L）对HepG2和SMMC-7721细胞进行NEAT1敲低,RT-qPCR检测NEAT1敲低效果,并对NEAT1敲低组（NEAT1表达量＜对照组40％）和对照组细胞（n=2）进行表达谱测序,检测NEAT1敲低后对HCC细胞各肿瘤相关基因表达的影响,对NEAT1敲低组和对照组细胞进行羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记（终质量浓度5μmol/L）的细胞（2×10^5个/孔）增殖检测、细胞计数试剂盒（CCK-8）进行细胞增殖检测（10 μl/2 000个细胞）、Transwell细胞侵袭移动能力检测来探究NEAT1对HCC细胞（2×10^5个/孔）增殖和侵袭功能的影响.结果 NEAT1在HCC细胞和癌组织中表达量高于癌旁组织（P＜0.01）,敲低HCC细胞株NEAT1表达导致很多参与肿瘤发生、发展通路的基因表达量改变（229个基因表达上调,148个基因表达下调,表达量改变超过2倍且P＜0.05）,敲低HCC细胞株NEAT1表达降低了HCC细胞体外增殖（P＜0.01）、侵袭（P＜0.01）的能力.结论 lncRNA NEAT1在人肝细胞癌的发生、发展中发挥了原癌基因的作用.

肝移植术后预存型供者特异性抗体介导急性排斥反应1例

昆明市第一人民医院肝胆胰血管外科暨肝移植中心收治1例肝移植术后不明原因肝功能异常的受者,排查肝功能异常原因并移植肝穿刺活检后考虑急性排斥反应,给予增加免疫抑制剂、激素冲击治疗后效果欠佳;考虑受者可能为肝移植术后抗体介导的排斥反应,给予完善供者特异性抗体(DSA)检查、移植肝C4d染色后明确诊断,给予血浆置换和静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗后肝功能明显好转,外周血DSA显著下降,随访时间>18个月,期间肝功能平稳,外周血DSA进行性下降、术后第18个月再次行移植肝穿刺活检发现小叶间静脉内膜和肝窦周C4d沉积仍为阳性染色,但组织学无排斥反应证据。

致敏大鼠肝移植后抗体介导的排斥反应的模型研究

目的建立同种异体致敏大鼠原位肝移植模型,研究该模型发生的排斥反应是否符合抗体介导的排斥反应(antibody-mediated rejection,AMR)的病理学特点。方法以12只雄性Lewis大鼠为受者,250~290 g,6只雄性Brown Norway(BN)大鼠为供者,250~280 g。将Lewis大鼠采用随机数字表法随机分为4组(n=3);Lewis对照组(LC组,未做任何处理)、直接移植组(T组,BN大鼠的肝脏直接移植于Lewis大鼠体内)、致敏组(S组,Lewis大鼠体内输入BN大鼠的脾脏淋巴细胞)和致敏后移植组(TS组,Lewis大鼠体内输入BN大鼠脾脏淋巴细胞2周后,进行肝移植)。于肝移植后大鼠存活第14天,收集受者非致死量血液3~4 mL,检测天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆红素(total bilirubin,TB)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和肌酐(creatinine,CRE)水平,并检测Lewis大鼠体内供者特异性抗体(donor-specific alloantibody,DSA)及补体C4d表达情况。采用苏木精-伊红染色和Masson染色评定4组大鼠肝脏组织的形态学指标,采用CK-19、C4d和CD20免疫组织化学染色方法评定4组大鼠肝脏发生排斥反应的程度并进行排斥反应活性指数(rejection activity index,RAI)评分。结果与T组相比,TS组Lewis大鼠的血清AST、TB和ALP水平以及DSA(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c)和C4d表达阳性率升高。与LC组相比,T组的Lewis大鼠出现部分胆管水肿及淋巴细胞浸润,但未见明显毛细血管结构的破坏;与T组相比,TS组Lewis大鼠的胆管前毛细血管出现大量的淋巴细胞或单核细胞浸润及毛细血管的严重破坏;TS组的RAI评分和C4d评分均高于T组。结论致敏大鼠肝移植后肝脏发生更严重的急性排斥反应和移植肝失功能,且致敏大鼠的急性排斥反应符合AMR的特点。由于本研究样本量较少,对AMR模型的探索还有待深入。