慢病毒载体p24蛋白含量的ELISA检测方法的建立与应用

测定慢病毒载体p24蛋白含量的商业化试剂盒存在成本高、检测线性范围窄和货源可控性差等不足,为解决上述问题,采用由一对鼠抗p24蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体与检测抗体,其中检测抗体进行生物素偶联来建立p24蛋白定量的双抗体夹心ELISA检测方法。通过方阵滴定法确定双抗夹心ELISA实验中的包被抗体与检测抗体的最佳工作浓度。对该方法进行了标准曲线线性范围、定量下限、准确度、精密度、特异性等的考察。取本公司自主研发生产的6个批次的慢病毒载体样品进行p24蛋白定量检测和放置稳定性来考察方法的适用性。实验结果显示,双抗夹心ELISA方法中包被抗体和生物素标记检测抗体的最优工作浓度分别为0.8μg·mL^(-1)和0.005μg·mL^(-1),方法在1.25~80.00 ng·mL^(-1)浓度区间有最佳线性,相关系数r2>0.95。批内和批间检测高、中、低质控品的回收率在80%~120%之间,变异系数均小于10.0%,定量检测下限为1.25 ng·mL^(-1)。同一种慢病毒载体6批次的p24蛋白含量检测结果均在30%偏差范围内,4批次样本放置8 h的稳定性检测结果偏差均在10%范围内。对双抗体夹心ELISA法进行了优化开发和全面验证,旨在提升慢病毒载体p24蛋白含量的定量检测水平,以及为慢病毒载体工艺开发、质量控制和批次之间质量的一致性研究提供重要的数据支撑和理论依据。

T细胞受体工程化T细胞的流式检测方法的建立

[目的]建立特异性识别乙肝病毒表面抗原的T细胞受体工程化T细胞(T cell receptor-engineered T cells, TCR-T)的流式检测方法。[方法]将3个检测抗体分别进行梯度稀释(死细胞指示剂FVS780:0.020~10.000μg/mL、鼠抗人的CD3抗体:0.039~20.000μg/mL和结合TCR的多肽-MHC复合物蛋白Dextramer-PE:1∶5至1∶2 560倍稀释)后,分别与同一TCR-T细胞共孵育,得出最佳使用浓度。两个不同分析人员采用此方法分别同时对3批TCR-T细胞样本进行3次检测,计算TCR阳性T细胞比例的CV值考察方法的中间精密度。同一分析人员分别检测2批TCR-T细胞的6个平行样本,计算TCR阳性T细胞比例的CV值考察方法的重复性。经组合染色后的TCR-T细胞采用荧光减一对照细胞样本进行梯度稀释得到12个不同TCR阳性T细胞比例的样本,检测后分析结果得到检测限和定量限。对同一工艺生产的3批TCR-T细胞的检测结果进行统计学分析。[结果]确定最佳抗体使用浓度分别为:FVS780:0.313μg/mL,CD3抗体:2.500μg/mL,PE-Dextramer:1∶20稀释。中间精密度考察3批TCR-T细胞检测结果的CV分别为3.2%、7.4%和2.2%。重复性考察2批TCR-T细胞检测结果的CV分别为2.1%、2.2%。3批产品批内差异统计的P值分别为0.706、0.706和0.09,均>0.05;批间差异统计的P值为0.171,>0.05。[结论]建立了特异性、精密度(CV<10%)和灵敏度(定量限为0.85%,检测限为0.45%)均良好的识别乙肝病毒表面抗原的T细胞受体工程化T细胞的流式检测方法。