人转化生长因子β诱导基因真核表达载体的构建及其对人角膜上皮细胞增生的影响

背景人转化生长因子-β诱导（TGFBI）基因是第一个被确定的角膜营养不良的致病基因，而TGFBI引起角膜营养不良的机制目前尚不清楚，研究TGFBI的功能对于揭示角膜营养不良的发病机制及了解角膜生理及病理功能都具有重要意义。目的构建人TGFBI基因的真核表达载体并将其转染于人角膜上皮细胞，探讨其对角膜上皮细胞增生及相关基因表达的影响。方法从角膜移植后剩余的供体角膜中提取人正常角膜组织总RNA，经逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）合成TGFBI cDNA，将TGFBI胶回收产物与载体pCMV—N-HA分别进行双酶切，取连接产物10μl转化100μl大肠杆菌感受态DH5α克隆入真核表达载体pCMV—N—HA，以菌落PCR和EcoRV、XhoI双酶切法测序鉴定。设置重组质粒pCMV—N—HA—TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组、阴性对照组及pGFP—C2转染对照组，以测定重组质粒转染率。重组质粒pCMV-N—HA—TGFBI转染人角膜上皮细胞，激光共焦显微镜下观察转染pGFP—C2后增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，用细胞计数试剂盒8（CCK-8法）检测转染细胞的增生情况，SYBR荧光实时定量PCR和Western blot法检测TGFBI、基质金属蛋白酶（MMPs）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）蛋白及其mRNA在转染后角膜上皮细胞的表达。结果pCMV—N-HA—TGFBI阳性克隆质粒进行经EcoRV和XhoI双酶切鉴定测序结果显示，扩增的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体，pGFP—C2载体转染人角膜上皮细胞后48h共焦显微镜下可见EGFP的表达，转染效率为70％。重组质粒pCMV—N—HA-TGFBI转染组TGFBI mRNA的表达明显高于空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组，TGFBI蛋白仅在pCMV—N-HA．TGFBI转染组表达。CCK-8法显示重组质粒pCMV—N-HA-TGFBI转染组、空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组间角膜上皮的吸光度（A450）值的差异无统计学意义（F=3．34，P〉0．05）。荧光实时定量PCR结果显示，重组质粒pCMV-N—HA-TGFBI转染组中MMP，mRNA、MMP，mRNA转录水平比空质粒pCMV—N—HA转染组和阴性对照组均升高（P〈0．05），而TIMP，mRNA则明显下降（P〈0．05）；Western blot结果证实MMP1、MMP3、TIMP1蛋白表达规律相同（P〈0．05）。结论人TGFBI基因真核表达载体可被成功构建并在人角膜上皮细胞中呈过表达。TGFBI可能是通过MMP1、MMP3及TIMP1的表达变化来增加细胞外基质的降解，从而参与角膜的某些生理病理过程。