关于定量分析免疫组织与细胞化学反应终产物图像的思考与商榷

本文对以测评抗原或抗体的量为目的,定量分析免疫组织与细胞化学反应终产物图像的整个过程,从三方面进行了比较全面的分析:(1)成像前的适合性评估,包括理论分析与准备、样品制备方法;(2)成像方式与过程控制,包括成像仪器的成像方式、成像仪器硬件数字化输出误差、成像仪器功能设置、图像的物理光学特性、细胞组织图像光度的线性检测、显微镜视场景深与成像缺陷的校正;(3)成像后的处理与分析,包括图像信息保真与图像存储格式、图像信息失真与图像处理、测量结果性质、测量结果表述、测量结果的误区与陷阱、测量结果间的比较。

医学本科生创新性实验计划管理模式初探

国家大学生创新性实验计划是培养学生创新能力和提升综合素质的有效途径。计划实施6年来已成为高校科研活动的有效补充形式。阐述了指导教师对实验计划顺利实施的有效管理方法,即将项目分割为若干技术环节,并固化为流程,建立高效、科学、注重细节的项目管理模式,介绍了从实际工作中获得的收获和体会,并提出有待解决的问题。

成纤维细胞生长因子信号调控早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移

目的利用Sprouty2基因阻断成纤维细胞生长因子(FGF)信号,探讨FGF在早期鸡胚胎发育过程中对神经嵴细胞迁移的影响及其机制。方法通过体内培养的方法孵育鸡胚至HH9期,通过显微注射的方法将Sprouty2-绿色荧光蛋白(GFP)质粒注射入神经管腔内。实验侧使用电穿孔转染的方法转染胚胎半侧神经管,另一侧正常神经管设为对照侧。采用神经嵴细胞特异标记物HNK1免疫荧光的方法检测Sprouty2基因阻断FGF信号后是否影响胚胎头部和躯干部神经嵴细胞的迁移过程。随后,进一步通过检测神经细胞钙黏分子N-Cadherin的表达来观察细胞之间黏附作用的改变。结果 HNK1免疫荧光检测结果显示,Sprouty2转染侧即阻断FGF信号通路后,HNK1在早期鸡胚胎的头部和躯干部的表达量均比对照侧的表达量增多;而神经细胞钙黏分子N-Cadherin检测结果表明,Sprouty2转染侧和正常对照侧N-Cadherin在头部和躯干部神经管上表达量的差异均无显著性。结论 Sprouty2基因阻断FGF信号后,促进了早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移,但是FGF信号对此过程的影响可能不是由神经钙黏分子N-Cadherin介导的。

人脐带间充质干细胞对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力的影响

目的观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对化学损伤(D-半乳糖+氯化铝)及海马物理损伤的拟阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠学习记忆能力的影响。方法 90只昆明小鼠采用D-半乳糖120 mg/(kg.d)、氯化铝20 mg/(kg.d)共同诱导10周以及海马物理损伤的方法分别复制出2种不同的拟AD小鼠模型。实验分为5组:化学损伤模型对照组、物理损伤模型对照组、化学损伤+hUC-MSCs治疗组、物理损伤+hUC-MSCs治疗组,另设一个空白对照组。hUC-MSCs移植治疗一段时间后,用Morris水迷宫和跳台仪分别检测小鼠学习记忆能力。结果与化学损伤模型对照组比较,化学损伤+hUC-MSCs治疗组小鼠水迷宫逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),跨越平台次数显著增加(P<0.05);跳台错误次数显著减少(P<0.05),潜伏期显著延长(P<0.05)。但物理损伤+hUC-MSCs治疗组与对应的模型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论侧脑室注射hUC-MSCs对化学性损伤拟AD小鼠学习记忆能力有改善作用。

转录因子Hand2在妊娠期糖尿病胎鼠心脏发育过程中的表达

目的:了解妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)母鼠胎鼠心脏发育过程中碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子Hand2表达的变化规律,探讨其在GDM胎鼠心脏发育异常中的作用机制。方法:114只成年雌性SD大鼠,空白对照组(n=24)、GDM组(n=30)、阴性对照组(n=30)及GDM+胰岛素干预组(n=30);空白对照组不予任何处理;GDM组腹腔注射2%链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;每只40 mg/kg);阴性对照组腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(STZ溶剂);GDM+胰岛素干预组在GDM建模成功后皮下注射中效胰岛素控制空腹血糖在正常范围。给药72 h后每天测血糖及体质量,各组分别于孕12 d(embryotic day 12,E12)、E15和E19剖取胎鼠心脏组织HE染色观察心脏组织病理变化,免疫组化检测Hand2蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测Hand2 mRNA的表达,Western blotting检测Hand2蛋白表达的变化。结果:各组Hand2蛋白的表达呈动态变化:E12可见表达,E15时表达增加,E19时Hand2蛋白表达最高,E12和E15 GDM组Hand2 mRNA及蛋白在胎鼠心肌细胞中的表达呈现下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:妊娠糖尿病母鼠其胎鼠心脏发育异常的发生率明显升高;Hand2 mRNA及蛋白在妊娠糖尿病胎鼠E12和E15心脏表达水平明显下降,提示与GDM胎鼠心脏发育异常相关。

辛伐他汀对血管内皮祖细胞复制性衰老的抑制作用及其机制

目的:探讨辛伐他汀对血管内皮祖细胞(EPCs)复制性衰老的影响,阐明辛伐他汀抗衰老的作用机制。方法:取第2代EPCs作为正常对照组,取第8代细胞作为实验组,分为高剂量辛伐他汀组(培养基中的辛伐他汀浓度为1×10-7 mol·L-1)、低剂量辛伐他汀组(培养基中的辛伐他汀浓度为1×10-8 mol·L-1)和复制性衰老细胞组。继续培养7d,流式细胞术检测各组细胞凋亡率、细胞周期以及Bcl-2蛋白的表达水平。结果:正常对照组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率低于其他3组(P<0.05或P<0.01);高剂量辛伐他汀组、低剂量辛伐他汀组和复制性衰老细胞组3组间早期凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05);与复制性衰老细胞组比较,高剂量辛伐他汀组和低剂量辛伐他汀组细胞的晚期凋亡率降低(P<0.01或P<0.05),高剂量辛伐他汀组与低剂量辛伐他汀组之间的细胞晚期凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,高剂量辛伐他汀组、低剂量辛伐他汀组和复制性衰老细胞组细胞大部分停滞于G0/G1期,S期及G2/M期减少(P<0.01);实验组3组之间各细胞周期细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组细胞Bcl-2蛋白表达的荧光强度和阳性表达率均明显高于其他3组(P<0.01);高剂量辛伐他汀组的荧光强度和阳性表达率高于复制性衰老组(P<0.05或P<0.01),低剂量辛伐他汀组的阳性表达率高于复制性衰老组(P<0.01),但荧光强度与复制性衰老组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:辛伐他汀可能通过降低Bcl-2蛋白的表达来延缓EPCs的复制性衰老。

人脐带间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞

目的探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外诱导向神经细胞分化的潜能。方法用生长因子bFGF和EGF联合全反式维甲酸(RA)、中药单体熊果酸、新生大鼠皮层神经元原代无血清培养的上清液3种方法,诱导hUC-MSCs向神经细胞分化,观察形态改变,用免疫细胞化学法检测神经细胞相关的标记物Nestin、Musashi-1和Tubu-lin、GFAP、O4。结果 hUC-MSCs经细胞因子、2 mg/L的熊果酸诱导后,细胞由成纤维状逐渐变成双极、多极或锥形,胞体缩小;有些细胞伸出突起,随时间推移逐渐伸长,有些可形成次级突起,相互连结形成网状。另有一些胞体呈球形,突起较短。新生大鼠皮层神经元原代无血清培养的上清液诱导hUC-MSCs先形成Nestin和Musashi-1阳性的神经球,再经历上述形态变化,分化形成神经元样细胞。hUC-MSCs经诱导14 d后,有少量细胞表达Tubulin、GFAP、O4。结论 hUC-MSCs在体外特定条件下,可诱导分化为神经细胞,作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。

孕期咖啡因暴露影响神经嵴细胞表达致先天性心脏病的机制

目的胚胎早期心脏发生的过程中过量咖啡因暴露,由于第二生心神经嵴细胞(CNCC)受到影响而导致心脏发育畸形。方法利用鸡胚为实验模型,在鸡胚心管发生发育的关键时期-HH9,按照正常组(PBS)、0.5μmol/egg组、1.0μmol/egg组、1.5μmol/egg组,连续3 d给予咖啡因暴露,至胚胎发育到12 d时获取胚胎用95%酒精固定2 d,对胚胎的心脏流出道(out flow tract,OFT)发育状态进行观察记录;,咖啡因暴露3 d后获取胚胎对CNCC进行检测,更深入研究其对心脏流出道发育机制的影响。结果胚胎早期心脏形成过程中,过量咖啡因暴露影响了CNCC的增殖、迁移,从而影响了心脏的正常发育,1.0μmol/egg组、1.5μmol/egg组分别出现心脏OFT的主动脉、肺动脉等发育畸形,并且有剂量依赖性。结论孕期大量咖啡因暴露通过影响第二生心区的CNCC的增殖和迁移路径导致心脏发育畸形,初步探究咖啡因暴露对胚胎早期心脏的发生发育影响的机制。

人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定

目的体外建立一种简便的人脐静脉血内皮克隆形成细胞(ECFCs)分离培养方法,并对其进行鉴定。方法无菌条件下收集脐静脉血,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNCs),诱导分化为ECFCs,倒置显微镜下观察其原代及传代培养细胞生长状况并通过流式细胞仪、免疫细胞化学、荧光双染色对ECFCs进行鉴定。结果 ECFCs培养过程可出现边界清楚的类圆形单层鹅卵石样细胞集落,细胞增殖能力强,连续传十几代细胞形态稳定,ECFCs高表达内皮系细胞表面抗原,而不表达造血系表面标记;可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1。结论通过简单、可靠的实验方法获得了ECFCs,为进一步探讨其生物学功能及临床应用提供了基础。

辛伐他汀对人脐静脉血晚期内皮祖细胞数量和功能的影响

目的:研究不同浓度辛伐他汀对体外培养的人脐静脉血晚期内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的影响。方法:用密度梯度离心法分离人脐静脉血单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养瓶,在EGM-2MV培养基中诱导分化获得晚期EPCs,并通过流式细胞术及免疫荧光染色进行鉴定。取生长状态良好的第2代晚期EPCs与不同浓度辛伐他汀(10-8、10-7、10-6及10-5mol/L)培养24、48及72h后,采用CCK-8增殖能力检测、粘附能力测定及血管形成实验来观察辛伐他汀对晚期EPCs增殖、粘附及血管形成能力的影响。结果:从人脐静脉血中成功分离并培养出晚期EPCs。与对照组相比,较低浓度辛伐他汀(10-8、10-7与10-6mol/L)对晚期EPCs的增殖、粘附及血管形成有明显促进作用,以10-7mol/L组作用最强;高浓度(10-5mol/L)则抑制EPCs的上述功能。辛伐他汀促增殖作用随时间延长而增加,而粘附与体外血管形成能力则在48h作用最强。结论:辛伐他汀在较低浓度时显著增加了晚期EPCs的数量并改善其功能,高浓度则起抑制作用。