用RNA-RNA原位杂交技术研究Robo2在早期鸡胚发育中的表达

目的:探讨Robo2(roundabout homolog 2)在早期鸡胚发育中的表达。方法:利用分子生物学手段,构建Robo2/pSPT18重组质粒,并且制备地高辛标记的Robo2 RNA探针,进而通过RNA-RNA原位杂交技术检测Robo2在早期鸡胚发育中的表达。结果:原条发生前Robo2表达较弱,原条发生后主要表达在原条和神经板。体节期Robo2主要表达在脊索、神经管、体节和血岛部位。冰冻切片后观察到Robo2主要表达在外胚层,而在中胚层和内胚层只有部分表达。结论:阐明了Robo2在早期鸡胚发育中的表达,为进一步研究Robo2在正常生理和病理条件下的功能及作用机制奠定基础。

Scribble在原肠期鸡胚表达的研究

旨在研究极性脚手架蛋白Scibble(Scrib)在原肠期的表达及意义,明确Scrib在早期鸡胚发育中的作用。以含有全长人Scrib的质粒pEGFP-N2-Scrib作为模板克隆出N端一段770 bp左右的片段,从而构建一个新的质粒pSPT18-Scrib;以pSPT18-Scrib为模板进行体外转录制备cRNA探针;并采用原位杂交的方法用此探针检测鸡原肠胚各个时期Scrib的表达情况。结果显示,Scrib在鸡胚四期开始逐渐在原条顶端及两侧的外胚层表达,并随着发育过程向外胚层两侧蔓延扩散,并且在发展到十期时呈现包括神经管和体节在内的广泛的弥散性表达。Scrib的表达规律提示在胚胎发育早期Scrib对外胚层细胞迁移和分化以及而后的器官发生起到重要的作用,为进一步研究Scrib在鸡胚早期发育中的作用提供参考。

疏肝健脾方药对NASH大鼠Kupffer细胞NF-κB p65和IKKβ mRNA及蛋白表达的影响

目的:探讨疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠Kupffer细胞核因子κB(NF-κB)p65和IκB激酶β(IKKβ)mRNA及蛋白表达的影响。方法:采用高脂饲料喂养复制大鼠NASH模型,在施以造模因素的同时分别灌服疏肝方(柴胡疏肝散)、健脾方(参苓白术散)和综合方(柴胡疏肝散和参苓白术散的合方)的高、低剂量进行干预,16周后分离Kupffer细胞,Typan blue染色和流式细胞术(FCM)分别对Kupffer细胞进行活性和纯度鉴定;实时定量PCR法检测Kupffer细胞IKKβ和NF-κB p65 mRNA的表达水平;Western blotting法检测Kupffer细胞IKKβ、p-IKKβ和NF-κB p65蛋白水平。结果:每只大鼠获得纯化的Kupffer细胞(1.5～2.0)×107,Typan blue染色显示这些细胞活力均在95%以上,FCM检测纯度均在90%以上;与正常组比较,模型组Kupffer细胞IKKβmR-NA及蛋白的表达水平均明显升高(P<0 01);与模型组比较,高剂量综合方、健脾方和疏肝方组IKKβmRNA的表达水平下调明显(P<0.01或P<0.05);IKKβ及磷酸化蛋白的表达水平以高剂量健脾方组下降最为显著(P<0.01或P<0.05);与正常组比较,模型组Kupffer细胞NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达水平均明显升高(P<0.01),与模型组比较,NF-κB p65 mRNA的表达水平以综合方组及高剂量健脾方组下调明显(P<0.05),NF-κBp65蛋白的表达水平以高剂量健脾方组下降最为显著(P<0.01)。结论:Kupffer细胞IKKβ、NF-κB p65 mRNA及IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白的高表达可能参与NASH的发病,抑制这些信号分子的表达可能是疏肝健脾方药抗NASH的重要机制之一。

三种阿尔茨海默病小鼠模型的建立和比较

目的建立并比较3种阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)小鼠模型的各自特点。方法 90只昆明小鼠随机分组,分别采用侧脑室Aβ25-35注射、侧脑室AlCl3注射、海马物理损伤的方法复制出3种不同的小鼠AD模型,通过Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力,组织切片观察海马的形态学改变,Aβ1-40免疫组化染色观察海马CA1区老年斑形成情况。结果侧脑室注射AlCl3组和海马物理损伤组小鼠学习记忆能力比对照组明显降低(P<0.05,P<0.01),物理损伤组小鼠海马神经元丢失明显,Aβ1-40免疫组化染色阴性;侧脑室注射AlCl3组小鼠海马CA1区偶见神经元排列稀疏,在神经元胞体和突起周围可见Aβ1-40免疫组化反应阳性的棕黄色斑块;侧脑室注射Aβ25-35组小鼠学习记忆能力、海马CA1区形态均与对照组无明显差异,海马区可观察到Aβ1-40免疫组化反应阳性的细小斑块。结论上述三种模型均为AD研究常用,但各自模拟AD的侧重点不同,技术要求、成本价格、造模时间、持续时间等也不尽相同,研究中需灵活选择。