长链非编码RNA LINC00987通过细胞色素P450途径促进AML细胞凋亡的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA LINC00987在抗肿瘤药物诱导的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞凋亡中的作用及分子机制。方法:通过RT-qPCR检测AML中的LINC00987表达水平。构建稳定敲减LINC00987基因的Molm13细胞(shLINC00987),通过Annexin V/PI检测LINC00987低表达对阿糖胞苷诱导AML细胞凋亡的影响。对LINC00987共表达基因进行信号通路富集,分析LINC00987的表达对细胞色素家族基因的影响。结果:与健康对照组相比,lncRNA LINC00987在AML细胞系和AML病人标本中均显著降低,而在抗AML治疗后缓解组中高表达;此外,低表达LINC00987与AML患者预后不良有关。抗肿瘤药物阿糖胞苷、阿霉素、三氧化二砷和维奈托克可显著诱导AML细胞系Molm13和MV411的LINC00987表达。下调LINC00987的表达可抑制阿糖胞苷诱导的Molm13细胞凋亡。进一步研究发现,LINC00987共表达基因可富集于细胞色素P450(cytochrome,P450,CYP450)介导的氧化应激通路/网络,且LINC00987的表达与CYP450家族基因CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的表达水平呈正相关。下调LINC00987的表达则可抑制阿糖胞苷诱导的CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的mRNA表达。结论:LINC00987可以作为AML的预后标志物,其可能通过CYP450介导的氧化应激途径促进阿糖胞苷诱导的AML细胞凋亡。

体外诱导小鼠胚内生血内皮细胞向造血分化的不同培养体系的比较研究

目的:比较二维平铺法和三维悬滴法两种培养体系对小鼠胚胎期生血内皮细胞体外诱导生成造血产物的支持作用。方法:分别利用二维平铺法和三维悬滴法将流式细胞术分选的造血干细胞潜能的生血内皮细胞PK44(CD41-CD43-CD45-CD31^(+)CD201^(+)Kit^(+)CD44^(+))群体与OP9-DL1-GFP基质细胞共孵育6 d后,在显微镜下观察两种培养体系产生造血产物的形态特点;利用流式细胞术分析两种培养体系孵育后的造血产物,并统计分析造血产物的比例和绝对数量;分别对两种培养体系共孵育后的造血产物进行造血细胞集落形成单位培养(colony-forming unit culture,CFU-C)实验,并对不同形态的细胞集落进行计数。结果:(1)利用二维平铺法形成的造血细胞平铺或悬浮于基质细胞上,而利用三维悬滴法共孵育后的产物形成了以基质细胞为中心,造血细胞黏附在周围的细胞聚集体。(2)二维平铺法产生更多CD45^(+)造血细胞;三维悬滴法对造血产物的分化具有谱系偏向性,更有利于肥大细胞的分化。(3)二维平铺法诱导生血内皮的分化产物在体外CFU-C实验中可以产生更多的造血集落。结论:二维平铺法更支持小鼠胚内生血内皮细胞体外诱导产生CD45^(+)的造血细胞以及有集落形成能力的造血干祖细胞。

急性髓系白血病新型预后分子标志物NKX2-3的发现

【目的】通过分析生物信息数据库中影响急性髓系白血病(AML)患者的预后的分子标志物的表达,为进一步探索AML预后的新型分子标志物提供实验基础。【方法】从癌症基因组图谱(TCGA)生物信息数据库中的179例AML患者的预后数据进行差异性基因分析及生存分析;利用基因表达集锦(GEO)数据库中的GSE13159数据集的74例健康人(HI)骨髓标本与542例AML初发患者骨髓标本进行分析,检测差异性目的基因表达水平在AML初发患者与健康人中的差异性;收集初发18例AML患者的外周血及骨髓样本,同时收集年龄和性别匹配的20例健康志愿者的样本作为对照,采用实时荧光定量PCR验证差异基因在AML患者体内的表达水平。【结果】生物信息数据分析显示,根据R语言计算出的NK2转录因子相关基因位点3(NKX2-3)的最佳截断值0.051进行生存分析,发现与低表达NKX2-3的AML初发患者相比,高表达NKX2-3的AML初发患者总体生存率较差(P=0.0036);与HI相比,NKX2-3在AML初发组患者中显著高表达(P<0.001);实时荧光定量PCR的验证结果也证实NKX2-3-1和NKX2-3-2在AML初发组患者中高表达,且与健康人组相比有显著相关性(P=0.000,P=0.000)。【结论】NKX2-3在AML初发组患者中高表达,且高表达NKX2-3的AML患者总体生存较差;NKX2-3可能与AML临床转归与预后密切相关。

RNA结合蛋白Rbm38在小鼠胚胎造血发育中的功能研究

目的:探究RNA结合蛋白Rbm38在小鼠造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)发育中的作用。方法:分析造血干细胞发育过程中连续群体的单细胞转录组数据,筛选生血内皮细胞(hemogenic endothelial cell,HEC)和/或造血干细胞前体(hematopoietic stem cell precursor,pre-HSC)阶段表达上调的RNA结合蛋白分子(RNA binding protein,RBP);利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除小鼠模型,将杂合型小鼠交配获得实验用胚胎,按照小鼠胚胎基因型不同将实验分为实验组和对照组,实验组为Rbm38^(-/-)基因型胚胎,对照组为Rbm38^(+/+)和Rbm38^(+/-)基因型胚胎;取材胚胎期11.5 d(embryonic day 11.5,E11.5)孕鼠胚胎的卵黄囊(yolk sac,YS),行体外造血细胞集落形成实验(colony forming unit-culture,CFU-C)检测主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和卵黄囊生成造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)的能力,行小鼠胚胎AGM区移植实验评价AGM区产生功能性造血干细胞的能力。结果:(1)Rbm38在动脉内皮细胞(arterial endothelial cell,AEC)向生血内皮细胞和Ⅰ型造血干细胞前体(type 1 pre-hematopoietic stem cell,T1 pre-HSC)的转化过程中表达明显上调,且在后续造血干细胞成熟的过程中维持高水平表达;(2)实验组和对照组E11.5小鼠胚胎AGM区和卵黄囊生成造血祖细胞数量以及其分化功能无统计学差异(P>0.05);(3)实验组和对照组移植后外周血嵌合率无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)多种RNA结合蛋白分子,如Rbm38,在小鼠生血内皮细胞与Ⅰ型造血干细胞前体阶段特异性高表达;(2)敲除Rbm38不影响小鼠胚胎AGM区和卵黄囊生成造血祖细胞的能力;(3)敲除Rbm38不影响小鼠胚胎AGM区产生功能性的造血干细胞。

小鼠胚胎新生造血干细胞的体内分化潜能研究

背景与目的 小鼠胚胎发育早期的新生造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)能够重建辐照后新生受体小鼠的造血系统,最早在胚胎期(embryonic day,E)第9.0 d(简称E9.0)检测到。第一个能够重建成体小鼠造血系统的HSC出现于E10.5的主动脉–性腺–中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区。然而,目前关于小鼠E10.5 AGM区细胞移植新生小鼠后的多系分化潜能的研究尚需完善。因此,本研究旨在通过建立新生小鼠移植体系,探究小鼠E10.5 AGM区新生HSC的多谱系重建潜能。方法 将小鼠E10.5 AGM区细胞(CD45.1+CD45.2+)以3个胚胎量移植进辐照(5 Gy)后的新生小鼠(CD45.2+)体内,从移植后4周开始,每月随访受体外周血的嵌合情况。并在移植后28周,通过流式检测分析新生HSC贡献不同组织部位中不同谱系的能力。结果 小鼠E10.5 AGM区细胞在新生小鼠移植后均获得了造血重建(n=4)。移植后28周,受体外周血的平均嵌合率为92.1%±2.0%,骨髓造血干祖细胞群体的嵌合率与之相当。进一步分析不同组织内成熟谱系的嵌合率,发现髓系亚群的嵌合率大多在85%以上,而脑中巨噬细胞(27.7%±6.6%)及非经典单核细胞(Ly6Clow单核细胞)的嵌合率(44.0%±4.0%)较低(P <0.0001)。淋系亚群的嵌合结果显示,腹膜腔和脾脏中B细胞亚群的嵌合率均在70%以上,胸腺中NK细胞的嵌合率(66.5%±5.4%)低于Treg细胞(95.2%±4.2%)和γδ T细胞(93.5%±3.6%)。结论 小鼠E10.5 AGM区来源的新生HSC能够重建辐照后新生小鼠的造血系统,并具有多谱系分化潜能。后续我们将围绕小鼠胚胎AGM区新生HSC特征性表面标志的筛选、胚内AGM区及胚外卵黄囊新生HSC的功能异质性的比较等方面进行深入探究。

胚胎造血干细胞发育全程线粒体动态特征及功能研究

目的:描绘线粒体在小鼠胚胎造血干细胞发育全程的动态特征并探究线粒体在此过程中的功能。方法:分析小鼠胚胎造血干细胞发育动态连续群体的单细胞转录组数据,描绘线粒体及能量代谢相关基因的动态变化特征;利用荧光探针染色结合流式细胞术对上述各个阶段细胞内线粒体的数量及膜电位进行检测,探究造血干细胞发育过程中线粒体数量和活性的动态变化特征;在共孵育诱导体系中加入抑制线粒体合成及能量代谢的小分子抑制剂,并结合造血集落形成实验评价抑制线粒体功能后对于体外造血诱导的影响。结果:(1)单细胞转录组数据分析显示,相较于糖酵解相关基因,线粒体合成及氧化磷酸化相关基因在生血内皮细胞和I型造血干细胞前体阶段呈现显著高表达,并且这部分基因能够显著区分连续动态发育群体。(2)荧光染色及流式细胞术结果显示,线粒体数量和膜电位在从生血内皮细胞到造血干细胞前体的连续发育过程中呈现不断上升的趋势,在II型造血干细胞前体阶段达到最高,而在胎肝造血干细胞中有所下降。(3)体外共孵育及造血集落培养结果显示,与对照组相比,抑制线粒体呼吸链I和V能够显著减少胚胎主动脉-性腺-中肾区CD31+细胞诱导产生的造血集落数量(P<0.05)。结论:(1)线粒体合成及氧化磷酸化相关基因在生血内皮细胞和I型造血干细胞前体中显著高表达,并能区分连续发育群体;(2)线粒体数量和膜电位在造血干细胞连续发育过程中不断上升,在II型造血干细胞前体中达到最高;(3)体外抑制线粒体呼吸链I和V能够显著降低造血产物生成。

多参数TOX免疫表型法的建立及在母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤中的应用

目的:建立多参数流式检测胸腺细胞选择相关高迁移率族蛋白(TOX)在PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞中的免疫表型法,以及其在1例罕见CD4-CD56^(+)表型的血液恶性肿瘤母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤(BPDCN)患者中的应用分析。方法:收集1例BPDCN患者骨髓(BM)和外周血(PB),2例非肿瘤手术患者和1例健康者BM以及11例健康者(HI)PB分别作为BM和PB对照组,利用多色流式单抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3、TOX、PD-1、Tim-3、CD244及相应同型对照进行流式细胞检测。结果:流式检测结果提示,BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)CD3^(+)、TOX^(+)CD4^(+)和TOX^(+)CD8^(+)T细胞比例均比对照组升高;BPDCN患者BM和PB中TOX^(+)PD-1^(+)CD8^(+)、TOX^(+)Tim-3^(+)CD8^(+)和TOX^(+)CD244^(+)CD8^(+)耗竭性T细胞中的分布比例也显著高于对照组。此外,在BPDCN患者BM和PB的CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg细胞中TOX^(+)细胞分布比例高于对照组;同时TOX^(+)细胞在PD-1^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg、Tim-3^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg和CD244^(+)CD4^(+)CD25^(+)FoxP3^(+)Treg耗竭性T细胞中的分布比例也明显高于对照组。结论:成功建立多参数流式细胞术检测PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T细胞亚群中TOX免疫表型法,TOX可能是BPDCN患者T细胞免疫调节的重要转录因子。

免疫检查点抑制剂在血液肿瘤中的研究进展

以抗程序性死亡受体1(PD-1)抗体为代表的免疫检查点抑制剂(ICI)在实体肿瘤治疗中取得重大突破。近年来ICI开始在血液肿瘤中应用,多项临床试验显示其具有较好的疗效并可显著改善患者预后。文章结合2020年第62届美国血液学会(ASH)年会报道,介绍ICI在血液肿瘤治疗中的相关临床研究进展。

靶向T细胞免疫治疗急性髓性白血病的策略

急性髓性白血病(AML)常伴有T细胞免疫功能不全,由于免疫检查点(IC)分子表达上调引起T细胞耗竭是其重要原因之一。利用IC抑制剂治疗AML有一定的临床效果,但患者T细胞耗竭的异质性很大,且还存在其他原因引起的T细胞免疫功能不全,多层面分析区分不同类型的免疫缺陷而采取相应的靶向T细胞免疫治疗才是理想的策略。

急性髓系白血病骨髓微环境中T细胞免疫稳态的预后和治疗价值探讨

骨髓微环境(bone marrow microenvironment, BMM)在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)的发生、发展中扮演着重要角色。研究表明,T细胞在正常BMM中具有维持免疫稳态、促进造血干细胞分化平衡的作用,而在AML状态下,BMM中的T细胞免疫稳态遭到破坏,呈现失衡状态,这提示BMM中T细胞免疫稳态失衡参与了AML的发生、发展过程。然而,目前关于AML患者BMM中T细胞免疫稳态失衡的特点以及这种失衡状态在患者预后判断和治疗中的价值尚未被充分认识。该文从T细胞在正常骨髓生态中的作用进行切入,进一步探讨BMM中的T细胞免疫稳态失衡对AML预后预测以及治疗的潜在价值。