大鼠亚慢性镉中毒模型的建立

为建立一种安全、简便和可靠的雄性大鼠亚慢性镉中毒模型,选取30只Wistar雄性大鼠随机分组后,每天分别用含1.25、2.5、5和10 mg/kg剂量的CdCl2溶液灌胃,研究镉离子在不同处理时间对雄性大鼠肝脏和肾脏的损伤情况。结果显示,大鼠血液和肝肾中的镉含量及血清中的尿素浓度与镉离子呈剂量效应关系。染镉56 d后,2.5、5及10 mg/kg处理组大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶活性分别为68.50±11.74、70.67±8.64和72.00±11.67 U/L,显著高于对照组(P<0.05)。病理组织切片结果表明,各处理组中的肝肾组织均出现不同程度的损伤。尽管模型组大鼠有明显的病理学指标变化,然而与对照组相比,镉对动物体重、血清中的乳酸脱氢酶活性以及肌酐含量的影响没有显著性差异。综合所有结果,每天口服浓度为5 mg/kg^10 mg/kg镉溶液且连续处理42 d^56 d,可以建立理想的大鼠亚慢性镉中毒模型。

穴蚁蛉幼虫全长均一化cDNA文库的构建

通过构建穴蚁蛉幼虫(俗称蚁狮)全长均一化cDNA文库,以期了解蚁狮的抗菌肽、毒素蛋白以及其它药用蛋白种类,为日后筛选、克隆表达和分离纯化这些药用蛋白奠定基础。用针刺诱导蚁狮产生抗菌物质后,分离纯化总RNA,结合SMART全长文库与DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建全长均一化cDNA文库,并通过平板计数和菌落PCR方法鉴定文库。随机挑选192个单克隆进行5′端测序,并与NCBI数据库进行比对分析。结果显示,构建出的文库平均插入片段长度为1 200 bp,原始文库的滴度达到7.5×105CFU/mL,而扩增文库则为1.95×1011CFU/mL。在所挑选的单克隆中,共获得190条有效序列,平均读长1 340 bp,文库重组率达到98.96%。与NCBI数据库比对后发现,这些序列可能是一些编码蚁狮免疫、消化及毒性蛋白的基因。

TAT-aFGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其生物活性测定

构建表达Tat与人酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)融合蛋白的重组质粒pET3c Tat-aFGF14-154和pET3c-Tat-aFGF27-154,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。37℃,1mmol/L的IPTG诱导4h后,获得分子量约为18kDa的融合蛋白,表达量分别占菌体总蛋白的42%和24%。利用阳离子交换(CM-Sepharose FF)、肝素亲和层析(Heparin-Sepharose CL-6B)以及分子筛(Sephadex G-25)联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白,得率分别为93ml/L和78mg/L。Tat-aFGF14-154及其对照蛋白aFGF14-154对Balb/c3T3细胞有明显促细胞增殖的作用,最佳作用浓度分别为1280ng/ml和160ng/ml。而Tat-aFGF27-154及其对照蛋白aFGF27-154则几乎没有促细胞增殖活性。免疫荧光分析结果表明,Tat-aFGF14-154及Tat-aFGF27-154均能穿过PC12、Balbc/3T3、HaCaT和海马神经元细胞的细胞膜,并主要定位于细胞浆中。此外,四种重组蛋白均能降低Aβ25-35对大鼠海马神经元细胞的毒性,在剂量为1000ng/ml时,Tat-aFGF14-154、Tat-aFGF27-154、aFGF14-154及aFGF27-154细胞存活率分别为90.66%、81.87%、85.71%和78.02%,而Aβ25-35模型组的存活率仅为56.87%。