GSK3β及其显性负突变体的原核表达与纯化

目的:构建原核表达GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及其显性负突变体(dominant-negative mutant)GST-GSK3β1 K85M的重组质粒,并进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。方法:利用PCR扩增和基因重组技术,以含有人源目的片段的质粒Flag-GSK3β1、YFP-GSK3β2及Flag-GSK3β1 K85M为模板,扩增出相应的目的基因片段,并将其插入具有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST融合蛋白表达质粒。通过对GST-GSK3β1、GST-GSK3β2和GST-GSK3β1 K85M融合蛋白进行诱导表达、温和法裂解以及纯化实验,确立有效的表达和纯化方法。最后应用Western blot方法鉴定纯化的融合蛋白。结果:成功构建GST-GSK3β及其显性负突变体质粒,并通过诱导表达和纯化得到目的蛋白。结论:GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及GST-GSK3β1K85M显性负突变体质粒的成功构建及目的蛋白的表达与纯化,为更深入地研究GSK3β蛋白的生物学功能奠定基础。

慢性乙型肝炎患者外周血外泌体HBV-miR-3与现有病毒学指标的关系

目的检测慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血外泌体中是否存在乙型肝炎病毒(HBV)-miR-3表达及其与生化学、现有病毒学指标之间的相关性。方法收集2016年9月-2017年3月在中山大学附属第三医院感染科门诊就诊的无抗病毒治疗的CHB患者外周血血清48份,健康对照者、丙型肝炎病毒(HCV)感染者、脂肪肝患者血清各12份,提取血清外泌体并检测HBV-miR-3滴度。同时检测患者外周血乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、前基因组RNA(pgRNA)等指标。分析CHB患者HBV-miR-3与现有病毒学指标的关系。结果 HBV-miR-3仅在CHB患者中检出,浓度为(6.41±3.55)log10 copies/mL,在健康对照者、丙型肝炎患者及脂肪肝患者外周血外泌体中均未检出。HBV miR-3与丙氨酸氨基转移酶无明显相关性(R2=0.047,P>0.05),与HBV DNA、pgRNA、HBsAg呈正相关(R2=0.311、0.336、0.811,P均<0.05),其中与HBsAg高度相关。e抗原阳性患者HBV-miR-3滴度显著高于e抗原阴性患者[(5.88±2.03)log10 copies/mL vs.(2.38±1.96)log10 copies/mL,P<0.05)]。在HBV DNA高病毒载量组、中病毒载量组、低病毒载量组和阴性组中HBV-miR-3定量分别为(9.09±1.08)、(6.08±2.19)、(5.24±4.23)和(4.55±3.96)log10 copies/mL,两两比较,高病毒载量组miR-3定量显著高于其他组别(P<0.05),其他三组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV-miR-3可在CHB患者外周血血清外泌体中检测到。在无抗病毒治疗CHB患者中,HBV-miR-3与HBsAg、HBV DNA、pgRNA呈正相关,其中与HBsAg高度相关。