珠江广州段微生物和浮游植物群落与水质特征研究

2008年5至2010年4月对珠江广州段中大码头和鱼珠码头的环境理化因子、可培养细菌总数、大肠菌群、粪大肠菌群以及浮游植物进行了为期2年的逐月调查。调查期间,2站点总氮平均浓度分别为(7.02±4.18)mg/L和(8.03±5.02)mg/L,总磷平均浓度分别为(0.47±0.29)mg/L和(0.50±0.27)mg/L;可培养细菌总数丰度为103～105个/mL,大肠菌群及粪大肠菌群丰度均在102～103个/mL范围内;浮游植物细胞密度为(1.50～13.17)×106个/L,硅藻门、绿藻门和蓝藻门为主要优势类群。浮游植物最高细胞密度出现在秋季,最低出现在夏季。2站点粪大肠菌群丰度超过地表水Ⅴ类标准,有机污染严重。以浮游植物作为评价指标,珠江广州段为富营养化水体,需加大对生活污水的治理力度。

植物响应温度胁迫蛋白质组学研究进展

温度胁迫是重要的非生物胁迫因子之一,对植物的生长发育、地理分布和品质产量等产生重要的影响。温度胁迫下植物的蛋白质组学研究可以系统揭示不同温度条件下植物蛋白质的表达状况,从而深入了解温度胁迫下植物的基因表达调控机制、植物响应温度胁迫机理。综述了植物响应高温和低温胁迫蛋白质组学的研究现状、存在问题和发展方向。

汕头南澳养殖海域微表层的环境特征及其水质评价

根据2010年5月对汕头南澳县深澳养殖水域的调查结果,对微表层的富集作用和不同养殖区的水质特点进行了分析.结果表明,微表层对多种物质均有富集作用.其中总氮(TN)、总磷(TP)、化学需氧量(COD)和细菌的富集因子分别为:1.68±0.55,1.45±0.53,2.30±0.91,2.58±1.87;NO2--N和NO3--N的富集系数分别为1.24±0.33和1.25±0.31.调查海域溶解性无机氮(D IN)均值为(12.74±5.65)μmol·L-1,主要以NO3--N的形式存在,为(9.63±5.40)μmol·L-1;PO4--P含量较低,均值为(0.52±0.46)μmol·L-1.根据海水水质标准,深澳养殖水域属于Ⅱ类水,水质较好,细菌丰度为(7.44±5.45)×105/mL.运用单因子污染指数法和综合营养指数(E)法对不同养殖区的水质进行了评价,鱼排养殖区主要为N污染.龙须菜对总氮、总磷和有机污染有较好的清除作用,消除率分别达到16.8%,26.0%和23.2%.

静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸／聚乙二醇纳米纤维作为组织工程支架的体外细胞相容性研究

目的探讨静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）／聚乙二醇（PEG）共聚物纳米纤维作为组织工程支架的可行性，及其与大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的体外相容性。方法静电纺丝法分别制备PLGA／PEG和PLGA纳米纤维支架，扫描电镜（SEM）观察材料结构；分离培养大鼠BMSCs，取第3代BMSCs分别接种于PLGA／PEG纳米纤维支架和PLGA纳米纤维支架进行培养，噻唑蓝（MTr）法测定其细胞毒性及细胞增殖；接种后2、4、6h血球计数板计数法测定其黏附率；DAPI荧光染色观察细胞核形态；SEM观察细胞和支架的形态、黏附及生长情况。结果SEM观察显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构。PLGA／PEG组和PLGA组纤维直径分别为（655±57）nm和（539±48）nm；孔隙率分别为86．8％±1．5％和84．7％±1．2％。MTr检测BMSCs在两组支架中生长良好，OD值均随时间延长而增大，两组各时间点比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。各时间段PLGA／PEG组的细胞黏附率明显高于PLGA组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。DAPI染色示各组细胞核形态正常，核质均染，未见明显凋亡及坏死细胞；PLGA／PEG组细胞较PLGA组明显增多。SEM观察显示，PLGA／PEG组BMSCs在支架上生长良好，基质分泌、生长睛况优于PLGA组。结论采用静电纺丝法制备的PLGA／PEG纳米纤维支架安全无毒，具备合适的孔径和孔隙率，适合BMSCs生长，细胞相容性良好，是一种组织工程良好的支架载体。

脂多糖持续刺激巨噬细胞的免疫学机制初探

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)的持续刺激下产生免疫抑制后的表型变化及对T细胞影响的分子机制。方法:蔗糖密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞,结合磁珠细胞分选技术分选出单核细胞,体外诱导单核细胞分化为巨噬细胞,以未处理和IFN-γ处理为对照,对LPS处理48 h的巨噬细胞进行形态学观察、细胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表达的检测和细胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的检测。同时将LPS诱导的巨噬细胞与CD3+T细胞进行异体共培养,进一步观察巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响。用实时荧光定量PCR验证Toll样受体4(TLR4)信号通路中的非My D88依赖型途径相关分子的表达水平。结果:LPS处理48 h的巨噬细胞,抗原递呈能力(HLA-DR)下降,免疫抑制细胞因子IL-10升高,把LPS诱导的巨噬细胞与异体T细胞共培养6 d,其促进CD8+T细胞增殖的能力较弱。实时荧光定量PCR结果显示LPS持续刺激下巨噬细胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下调状态。结论:持续LPS处理巨噬细胞48 h后,巨噬细胞呈现一种免疫抑制的状态,且其刺激CD8+T细胞增殖的能力减弱,这种状态与非My D88依赖型TLR4信号通路受损有关。

黄曲霉寡聚-1，6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工业酿酒酵母CICC1346中的表达

通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)扩增黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因和酿酒酵母α-信号肽序列,定向重组到整合型表达载体pδRCMB中,并在CICC1346中实现分泌表达;然后通过同源建模、利用分子模拟软件Discovery Studio 4.1分析其蛋白结构,以对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)为底物,建立并确定酶活反应条件,并进行纯化、酶学性质分析;将密码子优化后序列在CICC1346中实现分泌表达,利用淀粉进行共发酵实验。结果显示:重组酶突变后相对野生型蛋白结构无影响。SDS-PAGE分析重组重组酶大小约为70 kDa;优化后最高酶活达到0.69 U/m L,重组酶最适pH为6.5,在pH4.5.0~7.0维持90%以上的酶活;最适温度为40℃,在30~40℃维持接近100%的酶活;受Cu^(2+)和Mn^(2+)严格抑制;寡聚-1,6-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶及糖化酶协同利用淀粉产乙醇,提高淀粉水解效率。这是首次报道黄曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母整合型分泌表达。

GSK3β及其显性负突变体的原核表达与纯化

目的:构建原核表达GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及其显性负突变体(dominant-negative mutant)GST-GSK3β1 K85M的重组质粒,并进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。方法:利用PCR扩增和基因重组技术,以含有人源目的片段的质粒Flag-GSK3β1、YFP-GSK3β2及Flag-GSK3β1 K85M为模板,扩增出相应的目的基因片段,并将其插入具有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST融合蛋白表达质粒。通过对GST-GSK3β1、GST-GSK3β2和GST-GSK3β1 K85M融合蛋白进行诱导表达、温和法裂解以及纯化实验,确立有效的表达和纯化方法。最后应用Western blot方法鉴定纯化的融合蛋白。结果:成功构建GST-GSK3β及其显性负突变体质粒,并通过诱导表达和纯化得到目的蛋白。结论:GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及GST-GSK3β1K85M显性负突变体质粒的成功构建及目的蛋白的表达与纯化,为更深入地研究GSK3β蛋白的生物学功能奠定基础。

GST-NDPK-A融合蛋白的原核表达及体外互作蛋白的检测

旨在了解核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的功能,通过GST-Pull down技术寻找与其存在体外相互作用的蛋白。以含有目的片段的质粒pBV-NDPK-A为模板,扩增出相应的目的基因片段,将其插入带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达质粒。双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定融合蛋白的表达,并与高表达细胞系A549孵育,进行GST-Pull down试验,并通过LC-MS/MS质谱鉴定体外与NDPK-A相互作用的蛋白。结果显示,成功构建GST-NDPK-A的原核表达载体;在大肠杆菌BL21中诱导表达出可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了有生物活性的GST-NDPK-A融合蛋白,GST-Pull down试验和质谱鉴定结果发现NDPK-A与Fussel-18、Rrp12体外存在相互作用。

慢性乙型肝炎患者外周血外泌体HBV-miR-3与现有病毒学指标的关系

目的检测慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血外泌体中是否存在乙型肝炎病毒(HBV)-miR-3表达及其与生化学、现有病毒学指标之间的相关性。方法收集2016年9月-2017年3月在中山大学附属第三医院感染科门诊就诊的无抗病毒治疗的CHB患者外周血血清48份,健康对照者、丙型肝炎病毒(HCV)感染者、脂肪肝患者血清各12份,提取血清外泌体并检测HBV-miR-3滴度。同时检测患者外周血乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、前基因组RNA(pgRNA)等指标。分析CHB患者HBV-miR-3与现有病毒学指标的关系。结果 HBV-miR-3仅在CHB患者中检出,浓度为(6.41±3.55)log10 copies/mL,在健康对照者、丙型肝炎患者及脂肪肝患者外周血外泌体中均未检出。HBV miR-3与丙氨酸氨基转移酶无明显相关性(R2=0.047,P>0.05),与HBV DNA、pgRNA、HBsAg呈正相关(R2=0.311、0.336、0.811,P均<0.05),其中与HBsAg高度相关。e抗原阳性患者HBV-miR-3滴度显著高于e抗原阴性患者[(5.88±2.03)log10 copies/mL vs.(2.38±1.96)log10 copies/mL,P<0.05)]。在HBV DNA高病毒载量组、中病毒载量组、低病毒载量组和阴性组中HBV-miR-3定量分别为(9.09±1.08)、(6.08±2.19)、(5.24±4.23)和(4.55±3.96)log10 copies/mL,两两比较,高病毒载量组miR-3定量显著高于其他组别(P<0.05),其他三组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV-miR-3可在CHB患者外周血血清外泌体中检测到。在无抗病毒治疗CHB患者中,HBV-miR-3与HBsAg、HBV DNA、pgRNA呈正相关,其中与HBsAg高度相关。