蓝藻抗病毒蛋白-N的制备、生物活性鉴定及其多克隆抗体的制备和修饰

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。

蓝藻抗病毒蛋白N衍生物的细胞毒性及抗病毒活性检测

[目的]研究蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)衍生物(LCVN)对永生化上皮角质形成细胞(HaCaT)的毒性及LCVN凝胶的制备和体外活性检测。[方法]用MTT法测定LCVN对HaCaT细胞株的半数毒性浓度(CC50)以及LCVN对流感病毒毒株A/HK/8/68(H3N2)的半数抑制浓度(IC50);用流式细胞检测法检测LCVN对HaCaT细胞周期与细胞凋亡的影响;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测LCVN凝胶与HIV包膜蛋白GP120的相互作用。[结果]培养24和48 h后,LCVN对HaCaT的CC50分别为(9.25±1.21)与(1.94±0.12)μmol/L,将LCVN做成凝胶后,与HIV外膜蛋白GP120的结合在一定浓度范围内具有剂量关系,LCVN凝胶对A/HK/8/68(H3N2)毒株的IC50为(98.20±0.03)nmol/L。[结论]LCVN对HaCaT细胞的毒性明显小于CVN,当做成凝胶以后LCVN对流感病毒A/HK/8/68(H3N2)具明显抑制作用,并能与HIV包膜蛋白GP120相互作用。

中药艾的抗炎免疫研究进展及临床应用

艾作为我国传统中草药,药用历史悠久,具有抗菌、抗病毒、抗过敏、抗炎、抗疟疾、抗肿瘤等作用。艾的抗炎免疫作用主要表现在调节机体免疫系统、免疫活性细胞、炎性因子、补体等方面,治疗炎性肠胃病、类风湿性关节炎、炎性皮肤病等疾病均取得了良好的疗效。结合国内外研究进展,对中药艾的抗炎免疫研究进展及临床应用做简要阐述。

替莫唑胺联合粉防己碱对人脑胶质瘤U87细胞的抑制作用

目的探讨粉防己碱与替莫唑胺联合用药对人脑胶质瘤细胞U87细胞存活、克隆形成、迁移能力及凋亡的影响。方法采用CCK-8法检测粉防己碱8～64μmol·L^-1,或替莫唑胺50～400μmol·L^-1,或替莫唑胺＋粉防己碱3.2和6.4μmol·L^-1作用24 h后细胞存活率。粉防己碱6.4μmol·L^-1、替莫唑胺100μmol·L^-1或替莫唑胺＋粉防己碱3.2和6.4μmol·L^-1作用24 h后,Giemsa染色检测细胞的克隆形成;Transwell小室检测细胞迁移能力;流式细胞术AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡;Western蛋白质印迹法检测Bcl-XL、活化胱天蛋白酶3及活化聚ADP核糖聚合酶（PARP）蛋白表达。结果 CCK-8实验结果显示,单用粉防己碱和替莫唑胺均能抑制U87细胞的生长,且具有浓度依赖性（r=0.903,P〈0.05）,替莫唑胺100μmol·L^-1＋粉防己碱3.2和6.4μmol·L^-1抑制率高于两药单用,经分析两者作用为相加。替莫唑胺可抑制U87细胞的克隆形成和迁移能力,两药联用时比单用替莫唑胺抑制作用更明显（P〈0.05）;与单用替莫唑胺相比,两药联用时抗凋亡蛋白Bcl-XL明显减少,执行凋亡的活化的剪切胱天蛋白酶3蛋白及剪切PARP明显增多。结论粉防己碱联用替莫唑胺能明显抑制人脑胶质瘤U87细胞的生长、克隆形成及迁移能力,并诱导激活胱天蛋白酶3依赖的细胞凋亡。

高通量生物反应器Tubespin培养CHO细胞条件的优化

目的优化高通量生物反应器Tubespin培养CHO细胞的条件,提高蛋白表达量。方法采用Tubespin生物反应器在不同转速(160、180和200 r/min)和培养体积(5、10、20和35 ml)条件下振荡悬浮培养CHO细胞,测定不同条件下的气体交换速率、细胞密度、细胞活力及蛋白相对表达量,优化细胞培养条件。在最佳培养条件下,向培养基中分别添加30、60和90 mmol/L氯化钠,观察不同浓度氯化钠对细胞密度、细胞活力、摄氧率、溶氧及重组蛋白表达的影响。结果 Tubespin具有良好的气体交换速率,可满足高密度细胞培养的需要;经优化,细胞培养最佳条件为:摇床转速180 r/min,培养体积10 ml,此时细胞生长密度高,较快进入稳定期进行重组蛋白的表达。细胞培养72 h时向培养基中添加60 mmol/L氯化钠,能使重组蛋白的表达量提高1倍。结论优化了Tubespin培养CHO细胞的条件和氯化钠诱导浓度,提高了重组蛋白的产量,为大规模发酵生产奠定了基础。

CXCL12-α基因编码区的克隆与生物信息学分析

目的：克隆人源CXCL12-α的成熟肽编码序列后进行生物信息学分析及其蛋白质结构与功能预测。方法：采用RTPCR方法从人骨髓组织中克隆CXCL12-α基因序列,并将编码其成熟蛋白的核酸片段插入原核表达载体pET-30a（＋）中,转化Escherichia coli后进行酶切鉴定和DNA序列测定。利用在线网络生物信息学相关数据库和分析软件对测序结果进行分析,并对重组蛋白的一、二、三级结构及功能等进行验证和预测。结果：获得了基因序列为263 bp的人源CXCL12-α基因,与GenBank中公布序列一致。双酶切鉴定及DNA测序验证结果正确。生物信息学检索该基因编码蛋白的氨基酸序列与理化参数显示,蛋白无跨膜区,在第29位有一个Ser为蛋白激酶磷酸化位点,第1~21位可能为信号肽区域。ɑ-螺旋,无规则卷曲,延伸链和β-转角数量分别占总二级结构的44.94%、22.47%、21.35%、11.24%。同源建模预测信息可信度为0.68,该蛋白G-factor结构计分总平均为0.33,结构检验表明该蛋白属于正常范围内。二级结构和拓扑结构信息、蛋白质结合位点三维图和预测蛋白可能催化口袋及结合位点、三维结构模拟的可视化结构显示其空间结构稳定。结论：人源CXCL12-α分子克隆成功,网络数据库等生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测可为深入研究CXCL12-α提供理论指导。

人八聚体结合蛋白4(Oct4)cDNA的克隆及其在大肠杆菌和HEK293T细胞的表达

目的克隆人八聚体结合蛋白4(Oct4)c DNA,研究其在原核及真核系统中的表达。方法提取人宫颈癌He La细胞中的总RNA,经反转录PCR获得c DNA,PCR扩增Oct4 c DNA并将其分别克隆入表达载体p ET-22b(+)原核质粒和pc DNATM3.1(+)真核质粒,构建含该序列的重组原核表达载体p ET-22b(+)-Oct4和真核表达载体pc DNA3.1(+)-his-Oct4。然后分别进行双酶切和测序鉴定。前者在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至HEK293T细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测细菌和细胞中OCT4蛋白的表达水平。结果 PCR扩增得到约1100 bp目的 DNA片段;重组表达质粒p ET-22b(+)-Oct4和pc DNA3.1(+)-his-Oct4经双酶切鉴定和测序分析证明载体构建成功;p ET-22b(+)-Oct4经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主E.coli BL21(DE3)中高效表达OCT4融合蛋白,相对分子质量(Mr)约38 000,与其理论Mr基本相符;pc DNA3.1(+)-his-Oct4转染HEK293T细胞经Western blot法检测,证实导入的Oct4成功表达。结论在大肠杆菌和HEK293T细胞成功表达OCT4蛋白。

CBZ-AAN-Dox新前药的计算机辅助设计及合成与活性检测

目的探究一种以多柔比星为母药的低毒新型抗肿瘤前药。方法采用Sybyl 8.0的Sketch模块进行前药的计算机辅助设计,通过多种短肽共价偶联多柔比星形成前药库。虚拟筛选后用化学方法合成前药,通过硅胶柱和凝胶柱进行纯化,HPLC法检测与鉴定,体外特异性酶解试验及细胞毒性试验进行活性检测。结果计算机辅助药物设计所得到的新型前药N-苄氧羰基-丙氨酰-丙氨酰-天冬酰胺-多柔比星物理及化学参数较好,其化学合成产物纯度为94%,其天冬酰胺内肽酶酶解Km和Vmax分别为(68±7)μmol/L,(3.9±0.6)μmol/(L·s),对2种体外培养肿瘤细胞株的毒性作用约降低了约90%。结论计算机辅助药物设计在指导多柔比星前药合成过程中具有参考意义;前药合成与分离纯化方法简单可靠,分离效果好;新合成前药细胞毒性降低,可被天冬酰胺内肽酶酶解。

人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+)-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础。提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA。以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90AB1。将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经NdeⅠ和SalⅠ双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆。挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+)-hHsp90AB1。重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13%。接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶亲和层析,蛋白纯度达到98%。

GRP78在食管癌细胞ECA-109增殖过程中的功能研究

食管癌在中国是高发性肿瘤,并具有较高的致死率。肿瘤细胞的持续增殖与细胞增殖失调密切相关。肿瘤细胞在增殖过程中需要合成大量蛋白质,葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatedprotein,GRP78)作为分子伴侣,在蛋白质的折叠、组装、修饰和错误折叠蛋白的降解过程中发挥着重要作用。该研究通过构建pGRP78-EGFP-N1重组质粒,瞬时转染ECA-109细胞,研究GRP78过表达对细胞增殖能力的影响;采用RNA干扰技术,瞬时转染靶向GRP78的siRNA,研究敲低GRP78对细胞增殖能力的影响。该研究发现GRP78过表达后,更多的细胞从G1期进入S期和G2/M期,细胞增殖速率加快,细胞克隆形成率亦明显提高;敲低GRP78后,细胞更多地被阻滞在G1期而无法进入S期和G2/M期,细胞增殖速率减慢,细胞克隆形成率降低。GRP78可能通过调节细胞周期而促进ECA-109细胞的增殖。

蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性,该蛋白序列特殊,难以重组制备,在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列,构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化,发现以0.5mmol/LIPTG在20℃诱导24h可获得最高表达,SDS-PAGE结果显示,SUMO-CVN为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的28%;经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明,重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明,重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性;这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。

人干细胞生长因子-α基因的克隆、表达及其协同rhGM-CSF对人脐带间充质干细胞的增殖作用

为了研究hSCGF-α对人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的作用,采用基因工程技术获得重组人干细胞生长因子-α(Recombinant human Stem Cell Growth Factor-α,rhSCGF-α)。针对SCGF基因的高GC含量,采用PCR两步法获得hSCGF-α基因,插入pET-28a(+)载体质粒,构建重组质粒pET-28a-SCGF-α,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株。低温20℃诱导24 h,目标重组蛋白人干细胞生长因子-α以可溶性表达为主。通过Ni2+-NTA柱纯化,获得目标重组蛋白,电泳谱带扫描分析蛋白纯度可达90%以上。以巨噬细胞/粒细胞(Granulocyte/macrophage,GM)集落形成实验鉴定重组蛋白的生物学活性,并协同重组人巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子(Recombinant human GM-colony stimulating factor,rhGM-CSF)研究其对人脐带间充质干细胞的影响。结果显示,纯化的重组蛋白rhSCGF-α具有生物学活性;hSCGF-α及rhGM-CSF对hUCMSCs均有刺激增殖活性,但协同作用效果最强。

穿膜肽KGF-2的构建及其对HaCaT增殖作用的影响

目的:构建穿膜肽KGF-2(TAT-KGF-2),研究其对人角质形成细胞HaCaT的增殖作用。方法:采用普通PCR技术和特殊引物从人胚胎肺成纤维细胞cDNA中扩增出目的基因TAT-KGF-2,并将其插入pET-28a(+)载体中构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒;将该质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白TAT-KGF-2;通过Ni-NTA柱纯化获得目标重组蛋白并利用Western blot进行鉴定;MTT法研究TAT-KGF-2对HaCa的增殖作用。结果:成功构建pET28a-TAT-KGF-2重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人KGF-2基因序列同源性达到100%;获得穿膜肽KGF-2蛋白,分子量约为19 kDa,纯度达到95%以上;TAT-KGF-2对HaCaT在12.5ng/ml时具有增殖作用,并呈浓度依赖性,而且与不具有穿膜功能的KGF-2相比有更强的增殖效果。结论:成功纯化出TAT-KGF-2蛋白,并验证其对HaCaT具有增殖作用,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。

hSCGF-α穿膜肽的构建及其对hUCMSCs增殖作用的影响

目的:构建hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF),研究其对人脐带间充质干细胞的增殖作用。方法:采用基因工程技术将hSCGF-α基因重组插入pET-28a(+)质粒DNA,构建TAT-SCGF-28a重组DNA,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功高效表达,包涵体纯化后,通过实验比较hSCGF-α及hSCGF-α穿膜肽(TAT-SCGF)对人脐带间充质干细胞的增殖刺激作用。结果与结论:成功构建TAT-SCGF-28a重组DNA;纯化的蛋白纯度达90%以上;TAT-SCGF较不具有穿膜功能的SCGF对人脐带间充质干细胞有更强的增殖效果。

表达TNFR-Fc的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺的放大及其活性检测

目的观察在旋转振荡培养工艺放大条件下,表达肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)的重组CHO细胞稳定性及其表达产物活性。方法采用旋转振荡悬浮培养CHO细胞,至对数生长期时,接种不同培养体积(10 ml、250 ml、1.5 L),于31℃继续培养,每日取样检测不同培养体积下的细胞密度、细胞活力、融合蛋白浓度;经MabSelect Sure亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE、ELISA、MTT法进行纯化产物的相对分子质量和纯度及结合活性、中和活性的检测。结果重组CHO细胞在旋转振荡培养条件下,由10 ml放大到1.5 L培养体积时,细胞的生长密度、活力及蛋白表达量均相对稳定;纯化的融合蛋白纯度在94%以上,相对分子质量约75 000,可与重组人TNFα特异性结合,其相对亲和力与标准品十分接近,且可中和重组人TNFα的细胞毒效应。结论明确了表达TNFR-Fc融合蛋白的重组CHO细胞旋转振荡培养工艺放大的可行性,为更大规模发酵生产奠定了基础。

HSV-1 UL18基因重组载体的构建及其编码蛋白VP23的表达

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结果:UL18基因正确重组进pET-28a(+)质粒,并在E.coli BL21(DE3)中表达。结论:成功构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的重组载体,并在原核表达系统表达出其编码的衣壳蛋白VP23且带有组氨酸标签,为进一步优化VP23在发酵中的最佳表达条件,纯化并大量制备VP23,以及制备VP23的多克隆抗体奠定了基础。