人脐带内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养特征

目的:如何便捷有效地获取种子细胞是构建组织工程皮肤、角膜、血管等成功与否的关键,实验对人胎儿脐带内皮细胞和平滑肌细胞的分离、纯化、培养扩增技术进行探讨。方法:实验于2006-11在暨南大学医学院完成。①实验材料:剖宫产正常胎儿脐带由暨南大学第一临床学院提供,产妇均知情同意。②实验方法:配制培养液,A液为在M199培养液中加入20%胎牛血清、20mg/L肝素、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子,B液为在M199培养基中加入10%胎牛血清、250mg/LG418。取脐带15～20cm,采用胶原酶"灌注消化法"获取脐带内皮细胞制成悬液,静置0.5h后利用成纤维细胞短时间内贴壁的特点,把尚未贴壁细胞吸出重新接种于含有A液的培养瓶,初步去除部分成纤维细胞,细胞贴壁24h后将培养液换为B液,继续培养3d,去除成纤维细胞,然后再用A液扩大培养。从消化完脐静脉内皮细胞的脐带中剥取脐动脉,刮除内皮细胞,将血管条剪成小块均匀贴于培养瓶底,培养瓶内加入含20%小牛血清的DMEM培养液2mL,缓慢竖直培养瓶,以培养液刚未浸没培养块为最佳,放入37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内干涸8h后,将培养瓶轻轻翻转,使植块刚浸入培养液中,绝对静置3d,以后每3d换液1次,待植块周围生长晕的细胞融合成片时,即可传代,传代后DMEM培养液的血清浓度由原来的20%改为5%,且在培养液中加入0.2L肝素。③实验评估:通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况,分别以第Ⅷ因子、α-肌动蛋白免疫组织化学染色法鉴定内皮细胞和平滑肌细胞。结果:①内皮细胞的生长观察:接种24h后,镜下可见刚贴壁的细胞呈圆形,逐渐转变为多角形或梭形,胞间可见有成纤维细胞混杂,加入B液3d后成纤维细胞逐渐死亡。传代细胞呈"铺路石"样,细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕,为典型的内皮细胞生长特点。②内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的检测:胞浆丰富且有棕黄色颗粒,细胞核不着色,呈阳性反应。③平滑肌细胞的生长观察:镜下组织块贴壁后5～7d可见有少数细胞从植块边缘游出,第10～15天植块周围形成明显的细胞生长晕,细胞呈长梭形、带状或三角状,有1～4个细胞核,可见半透明颗粒,第20～25天细胞密集、平行排列,形成"峰谷样"结构,是平滑肌细胞的特征性生长表现。④平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白单克隆抗体检测:胞浆内可见棕黄色细丝,为特异性α-平滑肌肌动蛋白,细胞核不着色。结论:以胎儿脐带作为种子细胞的来源,成功分离后通过调节培养液的成分,既能排除成纤维细胞的污染又可以令内皮细胞和平滑肌细胞快速增殖。