小桐子磷酸葡萄糖变位酶cPGM与pPGM基因的克隆及原核表达分析

为了探究磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在植物蔗糖与淀粉代谢中的重要作用,基于同源序列比对的方法,在小桐子基因组中鉴定到1个细胞质型PGM基因(命名为JccPGM)与1个叶绿体型PGM基因(命名为JcpPGM),利用qRT-PCR方法检测JccPGM与JcpPGM基因在小桐子不同器官与低温条件下的表达特性,同时,构建了pGEX-4T-1-JccPGM与pGEX-4T-1-JcpPGM原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达分析。结果表明:两者分别编码582,637 aa的蛋白质。聚类分析表明,小桐子pPGM在其N端包含叶绿体定位信号肽,而cPGM较pPGM多4段肽链序列-^(108)VGVDGS^(113)-、-^(183)SGPE^(186)-、-^(283)GKSNSE^(288)-、-^(470)SLGEVN^(475)-。qRT-PCR表达分析显示,小桐子cPGM与pPGM基因都在叶片中高表达,而在根与种子中表达量较低。通过BL21(DE3)诱导表达,分别得到90.7,97.0 ku的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。综上所述,本研究为开展小桐子cPGM与pPGM基因表达蛋白的功能分析以及其在蔗糖与淀粉积累、逆境应答中的机制研究奠定了基础。

CBL-CIPK信号系统参与小桐子抗冷性形成的生物信息学分析

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like calcium sensor,CBL)属Ca^(2+)结合蛋白,通过与类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase,CIPK)互作介导Ca^(2+)信号转导过程。CBL-CIPK信号系统参与了植物对多种逆境胁迫的响应过程。为深入探讨小桐子的抗冷性机制,该研究基于BLAST序列比对的方法,在全基因组水平对小桐子CBL与CIPK基因家族进行了鉴定,并对其系统进化、基因结构、表达特性及功能互作进行了解析。结果表明:(1)在小桐子基因组中共鉴定到8个CBL基因与18个CIPK基因,CBL与CIPK蛋白长度分别在211~257 aa与422~484 aa之间,等电点分别在4.65~5.08与6.20~9.26之间。(2)另外,CBL基因家族都包含8~10个外显子,而CIPK基因家族分为显著的1~2个外显子(11个基因)和12~15个外显子(7个基因)两类。(3)多序列比对显示,小桐子CBL蛋白都鉴定到1个由14个氨基酸残基组成的非典型EF-hand基序与3个取代程度不同的典型EF-hand基序,而CIPK蛋白都包含N端激酶结构域与C端自抑制FISL/NAF结构域。(4)染色体定位显示,26个小桐子CBL与CIPK基因不均匀地分布于9条染色体上。(5)转录组数据分析表明,大部分CBL与CIPK基因在小桐子叶片、根及种子中都有高水平表达,其中JcCIPK14与JcCIPK18在低温处理时上调表达量达到了极显著水平(P<0.01),参与小桐子的抗冷性过程。综上结果为开展小桐子CBL和CIPK基因的功能鉴定与低温信号转导机制研究提供了借鉴。

小桐子SnRK2基因家族的全基因组鉴定及特征分析

蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶2(sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 2,Sn RK2)属植物特有的一类Ser/Thr类蛋白激酶,参与植物体内多种信号转导途径及逆境胁迫的应答。基于小桐子基因组数据,利用生物信息学的方法鉴定到7个小桐子Sn RK2基因家族成员,并对其从系统进化、理化性质、基因结构及顺式作用元件等进行了分析。结果表明,小桐子Sn RK2基因在进化上较为保守,并聚类为3个亚家族。基因结构包含9~10个外显子,编码的蛋白序列都鉴定到典型的激酶结构域以及C末端酸性补丁区域。同时,在Sn RK2基因上游调控区域都鉴定到多个激素与逆境应答元件。表达分析显示,Sn RK2.1、Sn RK2.2在低温处理下上调表达显著,经过干旱处理,7个小桐子Sn RK2基因在叶中都上调表达,而Sn RK2.1、Sn RK2.2、Sn RK2.5上调表达量达到极显著水平(p<0.01)。本研究为进一步的克隆小桐子Sn RK2基因以及研究其在信号转导与激素、逆境应答中的功能提供了参考。

小桐子光呼吸转氨酶GGAT与SGAT基因的克隆及原核表达分析

谷氨酸:乙醛酸氨基转移酶(GGAT)与丝氨酸:乙醛酸氨基转移酶(SGAT)是植物光呼吸中催化乙醛酸转氨基生成甘氨酸的关键限速酶。基于同源序列比对的方法,从小桐子基因组中鉴定到1个GGAT基因(命名为JcGGAT)与1个SGAT基因(命名为JcSGAT),基因长度分别为5 113和4 526 bp,分别编码481和401 aa的酶蛋白。氨基酸序列分析显示,小桐子GGAT与SGAT蛋白的C端过氧化物酶体定位信号肽分别为-SRM-与-SRI-。启动子区顺式作用元件分析表明,小桐子GGAT基因重点响应非生物胁迫信号如厌氧、干旱,而SGAT基因主要响应激素信号如脱落酸、赤霉素及茉莉酸甲酯。qRT-PCR表达分析显示, GGAT基因与小桐子的抗冷性直接相关。随着低温处理时间的延长,其表达量逐渐升高,并且在低温处理12 h时达到最大表达量,较对照显著提高4.74倍(P<0.01)。构建了小桐子GGAT与SGAT基因原核表达载体pGEX-4T-1-JcGGAT与pET-28a-JcSGAT,并在BL21(DE3)中诱导表达,分别得到81.0和47.8 kDa的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。