用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS-CoV

为从临床样品中检测和分析SARS CoV病毒打基础 ,并为分析SARS CoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法。以SARS冠状病毒TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片 ,探针长度为 70nt,每相邻的探针序列重复 2 5nt,共660条。用该芯片分析了细胞培养的SARS CoV病毒总RNA、7个SARS CoV病毒的基因克隆片段。对RNA样品用随机引物进行反转录PCR获得cDNA。对DNA用随机引物扩增和dUTP cy3标记。结果用这种芯片杂交检测SARS CoV病毒RNA可见阳性信号呈全基因组分布 ,并且有多处连续的阳性信号点 ;用正常人的白细胞RNA为对照 ,杂交未出现明显阳性信号。检测 7个SARS CoV病毒基因克隆片段 ,在该片段相应的探针区段出现连续阳性信号点。这种方法可有效地检测和分析样品中SARS冠状病毒全基因组的信息。

携带外源基因的rAAV-2在人树突状细胞中的稳定表达

目的:观察2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体介导外源基因对人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC)的感染效能.方法:采用激光共聚焦显微镜观察FTTC标记的rAAV-2进入DC的过程;用不同的感染复数(MOI)的rAAV-2-Luc和rAAV-2-GFP感染新分离的DC,荧光素酶(Luc)检测试剂盒检测Iuc的表达和流式细胞术(FACS)检测GFP表达细胞的百分率.结果:加入rAAV-2后80分钟就可见病毒吸附在DC膜上,至90分钟可完全进入细胞内;MOI为1×104vp/cell时就可检测到Luc的表达,并呈现出随着MOI的加大而提高的趋势,自MOI为5×105vp/cell起,再提高MOI值并不能明显增加luc的表达;rAAV-2介导外源基因感染DC48小时后就可检测到表达,从96～240小时表达水平无明显变化;GFP的表达率为5～18%.结论:rAAV-2介导外源基因能有效感染DC,感染的DC可稳定表达外源基因,rAAV-2载体体外遗传修饰的DC可以进一步用于ex vivo途径的免疫治疗研究.

白介素-18基因修饰人脑胶质瘤U87/hIL-18细胞的建立

目的构建人白介素18(hIL-18)基因真核表达载体质粒,建立hIL-18基因修饰并呈稳定表达的人脑胶质瘤U87/hIL-18细胞。方法从人淋巴细胞cDNA文库钓取hIL-18基因后行PCR扩增,利用pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建hIL-18真核表达质粒pcDNA3.1/hIL-18。将构建的重组质粒转染人胶质瘤细胞U87,采用G418筛选单克隆细胞株,ELISA检测培养上清中的hIL-18蛋白含量,提取细胞RNA,RT-PCR方法检测hIL-18基因在U87/hIL-18细胞中的表达。结果所得hIL-18cDNA序列与Gene Bank比对一致,构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染U87细胞后,经加压筛选获得hIL-18基因稳定、高效表达的U87/hIL-18单克隆细胞株,细胞培养72h的上清中,hIL-18蛋白含量达131.2pg/ml,且RT-PCR结果显示细胞中hIL-18基因表达呈阳性。结论成功构建hIL-18真核表达质粒pcDNA3.1/hIL-18,并建立U87/hIL-18单克隆细胞株,为hIL-18基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础。

血、便、痰和尿标本中SARS冠状病毒核酸的检测和病毒基因谱的初步建立

目的 :利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸并试图建立其基因谱。方法 :提取SARS患者血、便、痰和尿样本中的冠状病毒RNA ,经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针 ,与SARS病毒全基因组芯片进行杂交 ,同时用体外培养的病毒RNA和从健康人血液中提取的RNA做对照。结果 :SARS患者的 4种标本中都能检测到冠状病毒核酸的存在 ,与整个病毒基因组相比 ,大都为一些不连续的片断。其中尿、痰和便标本中的基因谱较为相似 ,另外 ,发现编码S1蛋白的核酸在一些标本中是连续的 ,具体为 2 3份血标本中有 2份是连续的 ,13份痰标本中有 8份是连续的 ,5 1份便标本中有 4 8份是连续的 ,2份尿标本中都是连续的。结论 :冠状病毒全基因组芯片能够检测出SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸 。

过表达p27基因抑制血管损伤后新生内膜的形成

目的 探讨p2 7基因转染对血管损伤后新生内膜形成的影响。方法 以腺病毒为载体转染p2 7基因 ,用MTT法观察其对血管平滑肌细胞增殖的影响 ,用流式细胞仪检测细胞周期 ;在兔颈总动脉球囊损伤模型上转染p2 7基因 ,采用免疫组织化学法检测p2 7基因的表达 ,检测其对新生内膜形成的影响。结果 p2 7可明显抑制培养的血管平滑肌细胞增殖 ,细胞停滞于G1期。兔颈总动脉球囊损伤后转染p2 7基因可以减少新生内膜的形成达 2 7 4 3%。结论 以腺病毒为载体转染p2 7基因可以有效地抑制血管平滑肌细胞增殖及血管损伤后新生内膜的形成。

全基因组扩增策略在基因芯片分析SARS冠状病毒实验中的应用

针对SARS冠状病毒的分子生物学检测是控制SARS流行的关键环节。为评价全基因组扩增对SARS微量样本检测的影响 ,采用 6 mer随机引物反转录 ,用加接头的随机引物合成第二链 ,再以接头序列为引物扩增并掺入荧光标记 ,最后与带有 70 mer探针的基因芯片杂交。此非特异方法基本覆盖了样本中的全部DNA ,结果发现SARS冠状病毒全基因组的扩增效果对基因芯片杂交结果的均匀性有较大影响 ,PCR循环次数增多会导致扩增均匀性的降低。分析了不同的引物对全基因组扩增均匀性的影响 ,探讨了全基因组扩增策略的缺陷。

新型冠状病毒血清学和病原学的临床相关研究

目的探讨SARS患者和康复者的血清学和病原学变化;筛选SARS康复者淋巴细胞中差异表达的基因。方法ELISA、冠状病毒全基因组芯片、抑制消减杂交(SSH)。结果80.4%的SARS康复者和2%的密切接触者SARSCoV的IgG抗体为阳性,康复后8个月内康复者抗体平均水平呈下降趋势;芯片能检测出血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸,发现编码S1蛋白的核酸在大部分标本中是连续的;SSH获得了SARS康复者淋巴细胞中差异表达的77个cDNA克隆,其中4个为未知的新序列。结论大多数SARS康复者产生了冠状病毒特异的IgG抗体;密切接触者中可能存在隐性感染者;冠状病毒全基因组芯片能检测出各标本中的病毒核酸并建立相应的基因谱;SSH文库为筛选新型冠状病毒特异的抗体基因奠定了分子基础。

一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法

腺相关病毒载体(adeno associatedviralvector,AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(>105v g /细胞),为此利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点,创造性地采用了一种用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法,达到了高效、快速浓缩AAV载体的目的。结果表明,乙醇沉淀法可以高效浓缩AAV载体,并且对病毒的结构和活性没有明显影响。用这种方法可以方便地将低滴度的AAV病毒变成高滴度,解决动物体内实验中每点注射体积受到限制的问题。

2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究

为揭示2型重组腺相关病毒感染哺乳动物细胞的一些转导特征,构建并制备了一种携带萤火虫荧光素酶基因的重组2型腺相关病毒rAAV2 Luc,研究了该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系;肝素对转导的拮抗作用;rAAV2的竞争抑制作用;丁酸钠对表达水平的增强作用。结果显示,在一定范围内,随着rAAV2 Luc感染细胞的感染复数(MOI即每个细胞感染的病毒基因组数)值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI(>107)反而使荧光素酶的表达水平下降。肝素可特异性阻断rAAV2介导的荧光素酶表达。携带不同基因的2种rAAV2病毒相互具有明显的竞争抑制作用。丁酸钠可显著增强rAAV2介导的荧光素酶表达水平。本研究对rAAV2载体介导的基因转移研究具有一定的指导意义。

抗人SARS病毒单链抗体库的构建

目的:利用细胞内重组的方法,构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库,为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础。方法:取6例SARS康复患者的80mL外周血,分离淋巴细胞后提取总RNA。分离纯化mRNA并反转录成cDNA后,扩增抗体重链、轻链可变区基因片段。然后经重叠延伸PCR装配成scFv基因并克隆入噬粒载体pDAN5中,电转化大肠杆菌TG1构建初级抗体库。制备初级库噬菌体后,感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组制备次级抗体库。结果:初级库库容量为3×109,在大肠杆菌BS1365中重组后得到3×1011的次级抗体库。结论:细胞内重组方法的应用可使大库容量抗体库的构建变得简单易行。构建的抗SARS病毒单链抗体次库不仅接近人类天然抗体库的水平,而且多样性好,为筛选抗SARS病毒抗原的抗体提供了保证。

重组腺相关病毒2型转导人外周血单核细胞来源树突状细胞的研究

树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)，能捕获、加工和提呈抗原,参与淋巴细胞的生长分化,并产生原发性CTL反应的细胞,在激活T细胞介导的免疫反应中起关键性作用[1].

人脑胶质瘤U87-hIL18-TK活疫苗的构建

目的制备hIL-18和TK双基因修饰的人脑胶质瘤活疫苗,检测HSV-TK/GCV系统对疫苗的体外调控作用。方法采用表达HSV-TK基因的慢病毒液感染U87-hIL18细胞,经G418和BSD抗性基因筛选获得U87-hIL18-TK单克隆细胞株,扩增传代获得双基因修饰疫苗,Elisa检测疫苗上清IL-18浓度,RT-PCR检测疫苗TK基因表达,MTT法检测更昔洛韦(GCV)对体外培养疫苗的杀伤效应。结果 TK基因成功转导入U87-hIL18细胞中,获得稳定表达IL-18、TK基因的U87-hIL18-TK胶质瘤活疫苗,体外杀伤效应显示10μg/mlGCV对活疫苗的杀伤率达90.3%。结论成功构建免疫基因和自杀基因共同修饰的胶质瘤活细胞疫苗,其在体内的安全性及免疫效能有待进一步研究。

AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法 从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于AAV载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒pSNAV U6 Luc。与pMAMneoLuc质粒共转染BHK 2 1细胞 ,检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株 ,检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果 pSNAV U6 Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制 5 0 % ,而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制 70 %。结论 实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK 2 1细胞中的表达。

Ad-LMP2重组腺病毒疫苗在恒河猴体内免疫效果的研究

目的 观察带有EBV-LMP2的非复制型Ad-LMP2重组腺病毒疫苗免疫恒河猴诱导的针对EBV-LMP2的特异性细胞和体液免疫应答.方法 分别使用高剂量（4.5×10^11VP/kg）、中剂量（1.5×10^11VP/kg）、低剂量（0.5×10^11VP/kg）三个剂量的Ad-LMP2重组腺病毒,肌内注射免疫恒河猴,每5 d免疫一次,共免疫6次,第7周时使用ELISPOT方法检测猴外周血细胞毒性T细胞应答,同时应用免疫酶方法检测血清中抗LMP2抗体.结果 3个剂量免疫恒河猴均可以诱导出有效的细胞免疫应答及一定的抗体应答,免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低有一定的关系,较高剂量产生的细胞及体液免疫应答水平比低剂量的要高.抗腺病毒中和抗体和抗LMP2抗体免疫2周后就可以检测到,其中抗LMP2抗体在免疫3～4周时滴度较高,7周时则与3～4周时接近或有所下降.结论 非复制型Ad-LMP2重组腺病毒疫苗可以有效的诱导恒河猴产生EBV-LMP2特异性细胞和体液免疫反应.

SARS病毒N蛋白特异性单链抗体的筛选

目的利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体。方法利用RTPCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因,克隆入原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95%以上的N蛋白,然后以此蛋白包被25cm2组织培养瓶,对SARS单链抗体库进行先松弛,后严谨的筛选、富集,进行4轮筛选后对所筛的抗体进行ELISA鉴定。结果经过4轮的筛选、富集,得到了1株高亲和力的N蛋白单链抗体N18。结论在对SARS疾病的早期检测或筛查、SARS病毒的生活周期及发病机理的研究中N18将起到重要的作用。