虾肝肠胞虫实时荧光RAA快速检测方法的建立

为了早期快速诊断近些年流行于国内的虾肝肠胞虫,根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫EHP-SSU rDNA序列比对分析,在SSU基因内确定了一段156 bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物和探针,经过优化重组酶介导的核酸技术(Recombinase-aid-amplification,RAA)反应条件,建立快速检测虾肝肠胞虫的RAA恒温荧光检测方法。在RAA进行到24个循环反应时可以检测到的质粒最小浓度是10 copies/μL,相当于10个病毒粒子。利用该方法,从天然感染EHP的虾肝胰腺组织DNA中可以检测出片段,而健康的虾和感染了传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合症病毒(WSSV)和虾虹彩病毒(SIV)的组织则没有扩增条带。试验表明,本研究建立的RAA恒温荧光检测方法具有快速、成本低、特异性好、准确性高的特点,为大范围早期病害的快速检测提供了新方法。

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。

Klenow(exo-)蛋白的制备及其在RAA检测体系中的应用研究

为了建立一种Klenow(exo-)蛋白的制备方法,并对其在RAA(recombinase-aid amplification)技术中的应用进行初步研究,通过Overlap点突变法构建获得目的基因片段,并构建Klenow(exo-)蛋白表达载体进而转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行初步纯化,然后用Heparine柱层析进一步纯化,通过SDS-PAGE鉴定纯化产物,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化后的目的蛋白配制RAA反应体系,针对肉源实际样本设计突变位点进行检测。实验结果显示该体系具有较强的特异性,在模板基因序列3′端出现双碱基差异时不会进行有效扩增,相较于常规的PCR检测方式该体系能够实现双碱基差异位点的有效区分。该技术未来有望大规模应用于SNPs的检测。

应用重组酶介导逆转录扩增技术快速登革病毒血清型鉴定

目的本研究建立了基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速鉴定登革病毒血清型的方法。方法选取登革病毒基因组NS1基因片段分别设计DV I型、DVⅡ型、DVⅢ型和DVⅣ型引物和探针,建立登革病毒血清型鉴定RT-RAA检测方法,并分别对其灵敏度、特异性和重复性进行测试。结果建立的方法检测时间短(<30min),与基孔肯雅病毒、黄热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒等黄病毒属病毒及DV不同血清型间无交叉反应,检测的灵敏度可达102copies/μl,试验的重复性好。结论建立的登革病毒血清型鉴定RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,为探究登革病毒是否本土化,确定登革病毒分子流行病学趋势提供技术支持。

乙脑病毒实时荧光重组酶介导逆转录扩增方法的建立

目的建立基于逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)快速进行乙脑病毒(JEV)分型鉴定方法。方法根据乙脑病毒NS1基因设计通用型引物和探针,针对E基因分别设计Ⅰ型和Ⅲ型JEV特异性引物和探针,建立JEV RT-RAA检测方法,并分别对其灵敏度、特异性和重复性进行测试。结果建立的方法检测时间短(<20 min),与登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒、寨卡病毒及无交叉反应,检测灵敏度可达100拷贝/μl,JEVⅠ检测体系的灵敏度可达10拷贝/μl;方法的重复性好。结论建立的JEV分型鉴定RT-RAA方法快速、特异、灵敏,适用于口岸现场JEV的快速检测。