镁黄长石浸提液促进人脂肪干细胞体外成骨分化的机制研究

目的:探讨镁黄长石浸提液促进人脂肪干细胞成骨分化的机制。方法:分离培养人脂肪干细胞,制备镁黄长石浸提液母液及浓度为1%和10%的镁黄长石浸提液。采用体外培养的第3代人脂肪干细胞分别进行以下实验:①将接种于镁黄长石生物陶瓷材料上的第3代人脂肪干细胞分为2组,A组以生长培养液培养、B组以生长培养液+成骨诱导液培养。分别于培养开始前及培养开始后1、4、7 d和10 d提取培养液的上清液,采用电感耦合等离子体-原子发射光谱技术测定Ca、Mg、Si离子的浓度。②采用镁黄长石浸提液母液+成骨诱导液培养第3代人脂肪干细胞,分别在培养开始后1、4、7、10、14、17、21 d以Western Blot法检测细胞的细胞外调节蛋白激酶和磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达情况,同时在培养开始后4、10、14、17 d测定碱性磷酸酶含量。③将培养的第3代人脂肪干细胞分为4组,Ⅰ组以生长培养液+成骨诱导液培养、Ⅱ组以1%镁黄长石浸提液+成骨诱导液培养、Ⅲ组以10%镁黄长石浸提液+成骨诱导液培养、Ⅳ组以镁黄长石浸提液母液+成骨诱导液培养。培养至第10天时,以West-ern Blot法检测4组细胞的细胞外调节蛋白激酶和磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达情况,并测定碱性磷酸酶定量含量。结果:①人脂肪干细胞体外培养过程中镁黄长石析出离子浓度。培养过程中不同时间点的Ca离子浓度不同(P=0.001);2组Ca离子浓度总体有差别(P=0.001),进一步比较,A组各时间点Ca离子浓度均高于B组[0 d:(1.65±0.03)mmol.L-1,(1.51±0.01)mmol.L-1,P=0.001;1 d:(4.78±0.18)mmol.L-1,(2.56±0.02)mmol.L-1,P=0.001;4 d:(3.27±0.11)mmol.L-1,(1.90±0.01)mmol.L-1,P=0.001;7 d:(3.24±0.03)mmol.L-1,(2.03±0.02)mmol.L-1,P=0.001;10 d:(3.14±0.02)mmol.L-1,(2.13±0.03)mmol.L-1,P=0.000];时间因素与分组因素存在交互效应(P=0.001)。培养过程中不同时间点的Mg离子浓度不同(P=0.001);2组Mg离子浓度总体有差别(P=0.001),进一步比较显示,除0 d外,其余各时点A组Mg离子浓度均高于B组[0 d:(0.09±0.00)mmol.L-1,(0.09±0.01)mmol.L-1,P=0.407;1 d:(0.46±0.02)mmol.L-1,(0.27±0.01)mmol.L-1,P=0.001;4 d:(0.27±0.01)mmol.L-1,(0.13±0.01)mmol.L-1,P=0.001;7 d:(0.26±0.01)mmol.L-1,(0.18±0.02)mmol.L-1,P=0.001;10 d:(0.24±0.01)mmol.L-1,(0.17±0.01)mmol.L-1,P=0.001];时间因素与分组因素存在交互效应(P=0.001)。培养过程中不同时间点的Si离子浓度不同(P=0.001);2组Si离子浓度总体有差别(P=0.001),进一步比较,除0 d外,其余各时点A组Si离子浓度均高于B组[0 d:(0.01±0.00)mmol.L-1,(0.01±0.00)mmol.L-1,P=1.000;1 d:(2.52±0.02)mmol.L-1,(2.05±0.06)mmol.L-1,P=0.001;4 d:(1.71±0.01)mmol.L-1,(0.53±0.01)mmol.L-1,P=0.001;7 d:(1.91±0.01)mmol.L-1,(1.14±0.01)mmol.L-1,P=0.001;10 d:(1.88±0.01)mmol.L-1,(1.24±0.01)mmol.L-1,P=0.001];时间因素与分组因素存在交互效应(P=0.001)。②镁黄长石浸提液作用时间对人脂肪干细胞成骨分化的影响。磷酸化细胞外调节蛋白激酶在第7天开始表达,第10天和第14天时表达量最高,第17天时表达量又降至基础水平。第4天、第10天、第14天、第17天ALP含量比较,差异有统计学意义[(3.68±0.80)nmol PNP.min-1.mg-1,(7.90±0.50)nmol PNP.min-1.mg-1,(7.79±0.53)nmol PNP.min-1.mg-1,(6.93±0.86)nmol PNP.min-1.mg-1;P=0.000]。进一步两两比较,第4天时ALP含量低于其余3个时间点(P=0.000),其余各时点两两比较,差异均无统计学意义。③镁黄长石浸提液浓度对人脂肪干细胞成骨分化的影响。体外培养至第10天时,各组细胞的细胞外调节蛋白激酶表达量基本相同,而磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达量略有差异,其中Ⅱ组表达量最高。各组细胞ALP含量比较,差异有统计学意义[(5.26±0.25)nmol PNP.min-1.mg-1,(5.76±0.15)nmol PNP.min-1.mg-1,(5.32±0.20)nmol PNP.min-1.mg-1,(5.32±0.25)nmol PNP.min-1.mg-1;P=0.024]。进一步两两比较,Ⅱ组含量高于其余3组(P=0.010,P=0.020,P=0.007),其余各组两两比较,差异均无统计学意义。结论:镁黄长石浸提液可以促进人脂肪干细胞成骨分化,且具有浓度依赖性,其机制可能与镁黄长石析出的Ca、Mg、Si离子激活细胞外调节蛋白激酶转导通路有关。