生脉饮多糖提取工艺优化及对脾虚模型大鼠肠道功能调节作用的研究

目的:优化生脉饮多糖的提取工艺,并探讨生脉饮及其多糖对脾虚模型大鼠肠道功能的调节作用。方法:采用硫酸苯酚法测定多糖含量,并计算多糖提取率;以此为考察指标,采用单因素试验和正交试验,对生脉饮多糖提取工艺的料液比、提取时间、提取温度、提取次数进行优化,并进行验证试验。将80只雄性SD大鼠随机分为空白组,模型组,生脉饮低、中、高剂量组(350、700、1 400 g/L,按生药量计)和生脉饮多糖低、中、高剂量组(24.5、49、98 g/L,按生药量计),每组10只。除空白组外,其余各组大鼠均灌胃大黄水煎液10 mL/kg复制脾虚模型,每天1次,连续15 d。自第16天起,空白组和模型组大鼠均灌胃等容水,其余各组大鼠均灌胃相应药液,每天1次,连续10 d。观察各组大鼠的一般情况,记录体质量,并采用间苯三酚法或酶联免疫吸附测定法检测其血清D-木糖、胃泌素(GAS)、血管活性肠肽(VIP)含量。结果:生脉饮多糖最优提取工艺为料液比1∶10(g/mL)、提取时间45 min、提取温度80℃、提取次数1次。验证试验结果显示,3次提取的多糖提取率分别为7.43%、7.64%、7.80%(RSD=1.01%,n=3)。造模后,除空白组外的其余各组大鼠均出现了大便溏稀、体形消瘦、食量减小等症状,且其体质量和血清D-木糖含量均较空白组显著降低(P<0.01)。末次给药后,各给药组大鼠上述症状均有不同程度的改善,且除模型组外的其余各组大鼠的体质量以及各组大鼠血清D-木糖含量均较同组造模前或给药前显著增加(P<0.05或P<0.01);与空白组比较,模型组大鼠体质量和血清GAS含量均显著降低,血清VIP含量显著增加(P<0.01);与模型组比较,生脉饮中剂量组和生脉饮多糖低、高剂量组大鼠体质量以及生脉饮中、高剂量组和生脉饮多糖低、中剂量组大鼠血清D-木糖、GAS含量均显著增加,生脉饮各剂量组和生脉饮多糖低、中剂量组大鼠血清VIP含量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:优化的生脉饮多糖提取工艺稳定、可行。生脉饮及其多糖可有助于恢复脾虚模型大鼠的肠道功能,这种作用可能与其调节肠道GAS、VIP等因子分泌有关。

癌胚抗原单链抗体在细菌表面的展示及其应用

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)作为肿瘤标志物,在临床肿瘤诊断及肿瘤靶向治疗等方面具有重要应用价值。癌胚抗原单链抗体(CEA-specific single chain antibody fragments,CEA-scFv)能够特异性结合癌胚抗原。本研究将癌胚抗原单链抗体展示于大肠杆菌细胞表面,分析其作为癌胚抗原检测平台和细菌靶向载体的可行性。首先将CEA-scFv基因克隆到表面展示载体pBAD-OmpA-m Cherry中,经酶切和测序证实,成功构建了重组质粒pBAD-OmpA-mCherry-CEA。重组菌经阿拉伯糖诱导后可检测到红色荧光,荧光强度在胰酶的作用下降低,全菌ELISA检测呈阳性反应,提示融合蛋白和目的蛋白质在重组菌表面展示成功。由Western印迹分析可知,融合蛋白质的相对分子质量约为85 k D,符合预期设计。进一步的研究提示,重组菌在大肠杆菌表面展示的癌胚抗原单链抗体具有生物活性,能够有效结合A549细胞裂解液的癌胚抗原。在细菌侵染细胞实验中,与对照组相比,重组菌孵育A549细胞后细胞内可明显观察到点状红色荧光,证明重组菌能够靶向侵入癌胚抗原阳性肿瘤细胞。本研究为癌胚抗原相关的快速诊断和基于细菌载体的肿瘤靶向治疗奠定了实验基础。